phát triển của xạ khuẩn
3.3.4.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhằm lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzyme của chủng xạ khuẩn, các chủng xạ khuẩn được cấy vào môi trường, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 12 bình tam giác loại 100ml, mỗi bình cho 20ml (ở mỗi bình môi trường có đánh ghi điều kiện nhiệt độ khác nhau tương ứng với 2 chủng xạ khuẩn), nuôi lắc 220º vòng/ phút ở các thang nhiệt độ 25oC, 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 55oC. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường.
Nhằm xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn trên môi trường, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 14 bình tam giác loại 100 ml, mỗi bình chứa 20 ml môi trường ứng với các giá trị pH thay đổi từ 4-10 (ở mỗi bình môi trường có ghi các giá trị pH khác nhau, tương ứng với 2 chủng xạ khuẩn). Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH của môi trường. Cấy các chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào các bình môi trường, đem nuôi lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ 30oC trong 48 giờ. Sau đó lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng
không đổi để xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.3. Khả năng chống chịu nồng độ muối khác nhau:
Nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của NaCl tới khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn, trong nghiên cứu này cần chuẩn bị 14 bình tam giác loại 100 ml, mỗi bình cho 20 ml môi trường vào với nồng độ muối thay đổi từ 0-1-3-5-7-9-11% (ở mỗi bình môi trường có đánh dấu ở các nồng độ muối khác nhau, tương ứng 2 chủng xạ khuẩn). Sau đó tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở 30oC trong 48h, theo dõi sự sinh trưởng của chúng. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.4.Xác định nhu cầu oxy:
Nhằm nghiên cứu nhu cầu sử dụng oxy cho sự sinh trưởng và sinh enzyme của 2 chủng xạ khuẩn cần tiến hành nuôi chúng trên các thể tích môi trường khác nhau. Các chủng xạ khuẩn sau khi được hoạt hóa trên môi trường, tiến hành lấy 1000 µl cho vào10 bình tam giác có dung tích là 500ml chứa thể tích dịch môi trường lần lượt là 25ml, 50ml, 75ml, 100ml, 125ml, 150ml nuôi lắc 220 vòng/phút ở nhiệt độ là 30oC trong 48 giờ. Sau 48 giờ dùng pipet hút chính xác 20ml dịch ở mỗi bình và tiến hành lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của nồng độ oxy tới khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.5.Khả năng sử dụng nguồn cacbon:
Nhằm xác định khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym trên cơ sở thành phần của môi trường, chỉ thay thế tinh bột bằng các nguồn cacbon khác
nhau với nồng độ như nhau: Tinh bột (1%), Xenluloza (1%), Glucose (1%), Saccaroza (1%), Lactose (1%),CMC (1%). Sau khi khử trùng ướt môi trường (1atm/30phút) ta tiến hành cấy các chủng xạ khuẩn vào các bình dung tích 100ml chứa 20ml môi trường rồi đem đi nuôi lắc trong thời gian 48 giờ ở 30oC cho các chủng phát triển. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Dịch lọc dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.3.4.6.Khả năng sử dụng nguồn Nitơ:
Xác định khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym trên cơ sở thành phần của môi trường, chỉ thay thế KNO3 bằng các nguồn nitơ khác nhau với nồng độ bổ sung 0,25%. Sử dụng các nguồn nitơ khác nhau: Pepton, cao nấm men, KNO3 (NH4)2SO4, bột đậu tương. Sau khi khử trùng ướt môi trường (1atm/30phút) chia vào các bình tam giác 100ml (mỗi bình 20ml). Sau đó cấy các chủng xạ khuẩn vào các bình môi trường với số lượng sinh khối bằng nhau rồi đem nuôi lắc trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ là 30oC. Sau 48 giờ ngày lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô 45oC đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn. Dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn.
3.4. Lên men trên thiết bị Infors HT (Switzerland) và tạo chế phẩm
Nhân giống cấp 1: Nhân giống trong môi trường Gause I dịch thể, nuôi cấy trong bình tam giác ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Nhân giống cấp 2: Các chủng giống cấp 1 đã phát triển tốt được cấy chuyền bình môi trường lỏng với tỷ lệ 10% giống nuôi ở 30oC.
Lên men: Tiếp giống từ giống cấp 2 sang thiết bị Infors HT (Switzerland) đã cài đặt những thông số thích hợp( dựa trên kết quả nghiên cứu trên). Nghiên cứu động học lên men của từng chủng xạ khuẩn trên thiết bị lên men Infors HT (Switzerland) đã cài đặt các thông số tối ưu, nguồn cacbon, nitơ thích hợp bằng cách xác định lượng sinh khối khô thu được trong 20ml dịch được lấy ra cứ sau 3 giờ chạy thiết bị, cứ sau 3 giờ lại lấy ra 20ml dịch
lên men, lọc và sấy khô tới giá trị không đổi, cân và thu kết quả sinh khối khô. Kết quả của lượng sinh khối khô lớn hay nhỏ thể hiện sự sinh trưởng mạnh hay yếu của chủng xạ khuẩn tại thời điểm đó. Ở pha log các tế bào sinh trưởng mạnh, nhân đôi một cách đều đặn, sinh khối tăng theo thời gian. Ở pha ổn định tế bào giữ được sự ổn định về kích thước và số lượng, các tế bào sinh ra tương đương với số tế bào chết đi, kết quả là sinh khối được giữ ở mức ổn định.Thường thì việc ly tâm thu sinh khối và enzyme thực hiện ở đầu pha ổn định.
3.5. Phương pháp nghiên cứu tính đối kháng
Ở vấn đề này chúng tôi tập trung nghiên cứu về giữa 2 chủng xạ khuẩn. Từ các chủng xạ khuẩn chúng tôi tiến hành cấy trên đĩa petri môi trường Gause I thạch đĩa đã được chuẩn bị trước. Mỗi chủng vi sinh vật được cấy theo một đường ngang và một đường dọc sao cho tất cả các chủng đều có điểm giao cắt lẫn nhau. Đem nuôi ở trong tủ ấm nhiệt độ là 30oC trong 5 ngày rồi quan sát sự đối kháng của chúng.
3.6. Phương pháp lựa chọn chất mang phù hợp
Nhằm lựa chọn chất mang phù hợp nhất cho chế phẩm, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thí nghiệm các cơ chất là than bùn, cám ngô, bột đậu tương. Tiến hành phối trộn các chất mang theo tỷ lệ (60: 30: 10; 50:40:10; 70:20:10) với tổng khối lượng đều bằng 10g, sau đó cho vào các bình 250ml mang đi thanh trùng ở 105oC trong 30 phút, để nguội. Từng chủng xạ khuẩn được nhân giống cấp 1, cấp 2 trong bình tam giác, rồi bổ sung 10% giống cấp 2 vào các bình hỗn hợp chất mang, trộn đều, nuôi trong tủ ấm 30oC. Sau 5 ngày đem các bình chứa 2 chủng xạ khuẩn tương ứng với các tỷ lệ ra tiến hành pha loãng tới nồng độ pha loãng là 10-4, hút 100µl dịch ở nồng độ pha loãng 10-4 và tiến hành cấy trải mỗi bình vào 2 đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn(có đánh dấu từng chủng tương ứng với tỷ lệ phối trộn), nuôi ở tủ ấm 28- 30oC, sau 5- 7 ngày đem ra đếm số lượng khuẩn lạc. Thông qua kết quả số lượng khuẩn lạc trung bình, có thể lựa chọn tỷ lệ các cơ chất nào phù hợp nhất.
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Tiến hành thí nghiệm, lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng không đổi, dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, protease của các chủng xạ khuẩn. Dựa vào kết quả lượng sinh khối cao nhất và kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất sẽ lựa chọn môi trường phù hợp nhất để làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả lựa chọn môi trường làm môi trường lên men và môi
trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo phụ thuộc vào lượng sinh khối khô(mg/ml) thu được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả lượng sinh khối khô thu được trong 20ml môi trường
Chủng Gause I Sinh khối khô (mg)Gause II ISP - 4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
T1 7,56 5,12 4,65
T4 7.72 6,24 3,78
Kết quả ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy lượng sinh khối khô thu được trong 20ml dịch của chủng Streptomyces sp. T1 lên men trong môi trường Gause I là 7,56(mg), trong môi trường Gause II là 5,12(mg), trong môi trường ISP – 4 là 4,65(mg) và của chủng Streptomyces sp. T4 trong môi trường lên men Gause I, Gause II , ISP – 4 lần lượt là 7,7 2(mg), 6,24(mg), 3,78(mg).Như vậy, lượng sinh khối khô thu được cao nhất của cả 2 chủng đều trong môi trường Gause I. So sánh trong môi trường Gause I thấy lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T1 thấp hơn lượng sinh khối khô thu được của chủng Streptomyces sp. T4 là 0,169(mg). Qua kết quả trên chúng tôi thấy môi trường Gause I thích hợp nhất cho cả 2 chủng sinh trưởng.
Kết quả lựa chọn môi trường nào thích hợp nhất làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo phụ thuộc trong môi trường đó kết quả đường kính vòng phân giải D – d(mm) cao nhất thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2
Bảng 4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của môi trường lên hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm).
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính cellulase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 17 13 12
T4 16 11 14
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 14 12 11
T4 13 11 12
Chủng xạ khuẩn Hoạt tính protease(đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Gause I Gause II ISP - 4
T1 13 9 10
Hình 4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường lên sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Kết quả trên bảng 4.2 và hình 4.2 cho thấy trong 3 môi trường lên men, dịch lên men ở cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều cho hoạt tính enzyme lớn nhất trong môi trường Gause I. Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh và hoạt tính enzyme của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu đã khẳng định( Nguyễn Văn Cách ,2004, Công nghệ lên men các chất kháng sinh),[3].
Với mục đích lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và sinh enzyme, căn cứ vào kết quả này tôi thấy môi trường Gause I là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.2. Kết quả một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và sinh enzyme của2 chủng xạ khuẩn 2 chủng xạ khuẩn
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ:
Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh enzyme. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn phụ thuộc vào kết quả lượng sinh khối khô thu được trong 20ml dịch môi trường thể hiện ở bảng 4.3, hình 4.3
Bảng 4.3. Kết quả sinh khối khô trong 20 ml dịch môi trường
Chủng Sinh khối khô (mg)
xạ khuẩn 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 13,04 15,65 13,48 14,05 5,13 0,98
Hình 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng
Kết quả ở bảng 4.3 và hình 4.3 cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn sinh trưởng mạnh trong dải nhiệt độ từ 30 đến 50oC, nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất là 30oC. Khi nhiệt độ nuôi dưới 20oC và cao hơn 50oC thì các chủng xạ khuẩn phát triển yếu. Điều này cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn đều là các chủng ưa nhiệt.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh tổng hợp enzym
của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng Hoạt tính cellulase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 10 22 21 19 6 0
T4 11 21 20 17 8 0
Chủng Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37o C 45oC 50oC 55oC
T1 10 24 23 15 13 3
T4 9 18 18 12 9 1
Chủng Hoạt tính protease(đường kính vòng phân giải D-d, mm) 20oC 30oC 37oC 45oC 50oC 55oC
T1 13 32 30 27 14 2
Hoạt tính cellulase (Đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính amylase (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hoạt tính protease (đường kính vòng phân giải D-d, mm)
Hình 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm )
Kết quả trình bày ở bảng 4.4 và hình 4.4 cho thấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC và chúng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease tối ưu ở nhiệt độ là 30oC. Nếu nhiệt độ nuôi xuống dưới 20oC và cao hơn 50oC thì khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase, amylase và protease của tất cả các chủng vi sinh vật đều yếu. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng của vi sinh vật cũng trùng với nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp enzym của chúng.Các chủng xạ khuẩn đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa ấm, nhiệt độ sinh enzyme có thể lên đến 45oC.
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất là 30oC cho 2 chủng xạ khuẩn sinh trưởng và có hoạt tính enzyme cao nhất.
4.2.2. Ảnh hưởng của giá trị pH
pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sinh trưởng của nhiều vi sinh vật. Chính vì vậy, việc xác định pH ban đầu thích hợp và việc duy trì pH trong thời gian sinh trưởng của xạ khuẩn là rất quan trọng. Từ những lý do trên ta tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu trong môi trường nuôi cấy lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn với độ pH thay đổi từ 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10 nuôi trên môi trường Gause lỏng ở 30oC trong 48h, sau đó tiến hành lọc sinh khối và đem sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 45 oC và xác định hoạt tính enzyme của chúng.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở bảng 4.5 và hình 4.5.
Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của các xạ
khuẩn nghiên cứu
Chủng Sinh khối khô(mg)
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10
T1 3,05 5,16 12,38 16,43 14,04 11,71 8,21
Hình 4.5. Kết quả ảnh hưởng của pH lên sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn
Kết quả thí nghiệm trình bày trên bảng 4.5 và hình 4.5 cho thấy các chủng xạ khuẩn có thể sinh trưởng trong môi trường có pH thích hợp nằm ở khoảng 6- 8 và phát triển tốt nhất ở pH=7. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường có ý nghĩa lớn trong nhân giống sản xuất chế phẩm.
Bảng 4.6. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) sau 48 giờ lên men ở 30°C