3.3.1. Phương pháp lựa chọn môi trường lên men thích hợp
Phương pháp thí nghiệm tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Văn Cách (2004) với một chút biến đổi phù hợp với thí nghiệm. Để lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất đáp ứng điều kiện vừa giúp cho chủng xạ khuẩn sinh trưởng tốt nhất vừa mang lại hiệu suất sinh enzyme cao nhất, tiến hành thí nghiệm sử dụng 3 loại môi trường lên men cơ sở là: môi trường Gause I dịch thể, môi trường Gause II dịch thể và môi trường ISP- 4 [3].
Tiến hành thí nghiệm: Nhằm nghiên cứu để lựa chọn môi trường lên men thích hợp nhất chúng tôi chuẩn bị 6 bình tam giác dung tích 100ml có chứa 20 ml môi trường (ở mỗi bình môi trường có đánh ghi 3 loại môi trường khác nhau tương ứng 2 chủng xạ khuẩn) sau đó tiến hành nuôi lắc 220 vòng/ phút ở 28- 30oC trong 48 giờ, theo dõi sự sinh trưởng của chúng. Sau 48 giờ lọc thu sinh khối và dịch lọc enzyme. Sinh khối đem sấy khô ở 45oC đến trọng lượng
không đổi, dịch enzyme dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường cellulose, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn. Dựa vào kết quả lượng sinh khối cao nhất và kết quả (D – d) cao nhất sẽ lựa chọn môi trường phù hợp nhất để làm môi trường lên men và môi trường sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn
Phương pháp thí nghiệm tiến hành theo phương pháp của Trần Đình Toại (2008) với một chút biến đổi nhỏ phù hợp với phòng thí nghiệm. Để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh trưởng ta tiến hành cần chuẩn bị đủ bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình chứa 20 ml môi trường nuôi cấy với các giá trị khác nhau thay đổi tùy từng yếu tố, nuôi trên môi trường được lựa chọn ở 30oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành lọc sinh khối và đem sấy khô đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 45oC. Chọn những giá trị của các yếu tố mà các chủng có khối lượng sinh khối khô lớn chứng tỏ chúng sinh trưởng mạnh ở những giá trị đó [15].
3.3.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng sinh enzyme và hoạt tính enzyme
Để xác định ảnh hưởng của các yếu tố như nhiệt độ, giá trị pH,nồng độ muối, nồng độ oxy,nguồn cacbon, nguồn nitơ tới khả năng sinh enzyme và hoạt tính enzyme thủy phân cellulose, tinh bột, protein của các chủng xạ khuẩn, tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch [15].
Cách tiến hành: Pha các môi trường phân giải cellulose, tinh bột, protein. Sau khi thanh trùng 1atm/30 phút, đổ môi trường vào đĩa petri. Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng 1 cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng thạch.
Chuẩn bị đủ bình tam giác loại 250 ml, mỗi bình cho 20 ml môi trường nuôi cấy với các giá trị khác nhau thay đổi tùy từng yếu tố, nuôi chủng xạ khuẩn trên máy lắc 220 vòng/ phút ở 30oC trong 48 giờ, sau đó tiến hành thu và lọc sinh khối xạ khuẩn. Thu dịch enzyme từ môi trường nuôi cấy bằng cách ly tâm 15.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ cặn. Nhỏ vào các lỗ khoan trên môi
trường cơ chất tương ứng dịch nuôi cấy xạ khuẩn. Sau đó đặt các đĩa vào tủ lạnh 4oC trong vòng 6 - 8 giờ rồi chuyển sang tủ ấm 30oC. Sau 12 - 24 giờ, xác định vòng phân giải bằng thuốc thử lugol. Cho vào mỗi hộp petri 10 ml thuốc thử, tráng đều bề mặt, gạn hết dịch thuốc thử, để 5 phút, vùng hoạt tính enzyme phân giải cellulose, tinh bột, protein là vùng phân giải không màu xung quanh lỗ đục.
Đánh giá khả năng sinh enzyme và có hoạt tính enzyme cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải là D. (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzyme càng cao (d là đường kính giếng, d =10mm). Chọn những giá trị của các yếu tố mà kết quả (D – d) lớn nhất.