CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Phân tích thành phần hóa học của nấm vân chi
Nấm nguyên liệu sau thu hái có độ ẩm cao và không đồng đều do chế độ trồng và thời điểm thu hái không đồng nhất. Để tạo ra sự đồng đều ở các mẫu thí ngiệm, tiến hành sấy sơ bộ bằng phương pháp sấy tiếp xúc ở 40oC trong 4 giờ và tiến hành phân tích các chỉ tiêu lý hóa chủ yếu của nấm vân chi.
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến độ ẩm nguyên liệu theo thời gian
Sau khi sấy nấm bằng phương pháp sấy tiếp xúc ở 40oC trong 4 giờ, tiếp tục nâng nhiệt độ và sấy cho đến khi độ ẩm nguyên liệu đạt dưới 10% thì kết thúc quá trình sấy.
Các nhiệt độ được lựa chọn để khảo sát trong quá trình sấy là 500C, 550C, 600C và 650C. Mẫu sấy được xác định độ ẩm sau mỗi 60 phút trong suốt quá trình sấy.
2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung
* Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung trà nguyên liệu:
Trên cơ sở tham khảo một số đề tài nghiên cứu về trà túi lọc nấm linh chi và các loại trà túi lọc khác, tôi lựa chọn bố trí thí nghiệm với 5 công thức tương ứng với tỷ lệ phối trộn nấm vân chi : trà nguyên liệu như sau:
Công thức 1: tỷ lệ 1:0,1 (CT1) Công thức 2: tỷ lệ 1:0,2 (CT2) Công thức 3: tỷ lệ 1:0,3 (CT3) Công thức 4: tỷ lệ 1:0,4 (CT4) Công thức 5: tỷ lệ 1:0,5 (CT5)
Sau khi phối trộn tiến hành pha trà với tỷ lệ 2 g trà/150 ml nước nóng 90 – 95oC và tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
*Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung cỏ ngọt:
Trên cơ sở lựa chọn được tỷ lệ bổ sung trà nguyên liệu được ưa thích tiến hành nghiên cứu tỷ lệ bổ sung cỏ ngọt. Thí nghiệm được tiến hành với 5 công thức như sau:
Công thức 6: tỷ lệ 0,05 (CT6) Công thức 7: tỷ lệ 0,08 (CT7) Công thức 8: tỷ lệ 0,11 (CT8) Công thức 9: tỷ lệ 0,14 (CT9) Công thức 10: tỷ lệ 0,17 (CT10)
Sau khi phối trộn tiến hành pha trà với tỷ lệ 2 g trà/150 ml nước nóng 90 – 95oC và tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng nước pha trà đến chất lượng cảm quan trà thành phẩm
Trên cơ sở lựa chọn được công thức phối trộn tiến hành nghiên cứu lượng nước pha trà. Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức tương ứng với lượng nước pha cho 2 g trà như sau:
Công thức 11: 130ml nước (CT11) Công thức 12: 150ml nước (CT12)
Công thức 13: 170ml nước (CT13)
Tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian hãm trà đến chất lượng cảm quan trà thành phẩm
Trên cơ sở lựa chọn được công thức phối trộn và lượng nước pha trà, tiếp tục tiến hành nghiên cứu thời gian hãm trà. Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức như sau:
Công thức 14: hãm trà trong 5 phút (CT14) Công thức 15: hãm trà trong 10 phút (CT15) Công thức 16: hãm trà trong 15 phút (CT16)
Tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.6. Thí nghiệm 6: Phân tích hàm lượng PSP, PSK trong nấm vân chi nguyên liệu, sản phẩm và nước pha trà thành phẩm
- Xác định khối lượng thô PSP, PSK: Tiến hành trích ly với dung môi là nước để xác định hàm lượng PSP, PSK [7], [26].
- Phân tích protein bằng phương pháp điện di và Bradford:
PSP/PSK trong các mẫu thí nghiệm được tách chiết bằng nước cất trước khi đưa đi kết tủa và chạy điện di trên SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel). Các mẫu được chuẩn bị riêng biệt với 10 g nấm tươi, 10 g nấm khô và 10 g trà thành phầm (sau khi phối trộn với nguyên liệu phụ) được tách chiết 3 lần với 250 ml nước cất mỗi lần (theo sơ đồ 1.3). Tổng 750 ml lượng dịch chiết được cô quay chân không ở 800C cho đến khi thu được 100 ml. Cho 45 g muối amôn sulfate (ammonium sulfate) vào 100 ml dịch cô quay để đạt được độ bão hòa 70%, khuấy đều đến khi muối tan hoàn toàn trong dung dịch, sau đó để ở 40C trong 4 giờ trước khi ly tâm ở 4oC, 12.000 vòng/phút để thu kết tủa. Lượng tủa này được hòa tan lại trong 5 ml nước cất và đưa đi thẩm tỏch 12 giờ trước khi lấy 30 àl để sử dụng bơm vào giếng điện di gel.
SDS-PAGE sử dụng cho thí nghiệm phân tách protein này là ở 10% như được mô tả trong tài liệu “Hướng dẫn điện di và phát hiện protein trên gel polyacrylamide”
của hóng Bio-Rad. 30 àL mẫu trộn với 5 àL dung dịch nhuộm protein, đun sụi hỗn hợp trong 5 phút, giữ lạnh trong đá 10 phút và bơm vào giếng trên phần gel cô (stacking gel). Sau khi protein được phân tách trong gel tách (separation gel) bằng quá trình điện di ở 120 voltage, trong khoảng 2,5 giờ, sau đó gel được tách khỏi hệ thống chạy gel và với thuốc nhuộm liên kết protein Coomassie brilliant blue. Protein trên gel được quan sát và ghi hình bằng máy đọc gel.
Để biết lượng protein tổng số đã dùng cho thí nghiệm chạy gel, tôi tiến hành đo protein tổng số bằng phương pháp Bradford dựa theo tài liệu của Bio-Rad “Quick Start Bradford protein assay” và đo mật độ quang ở bước sóng ʎ = 595 nm. Trong thí nghiệm này tôi sử dụng BSA (Bovine serum albumin) để xây dựng đường chuẩn.