CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Nội dung nghiên cứu
2.4.2. Phương pháp thu thập số liệu
2.4.2.3. Đặc điểm xét nghiệm dịch khớp
Mẫu dịch khớp được gửi đến Trung tâm Huyết học truyền máu (làm xét nghiệm tế bào trong dịch) và Khoa Vi sinh làm xét nghiệm nhuộm soi tìm vi khuẩn và nuôi cấy phân lập vi khuẩn.
* Xét nghiệm tế bào trong dịch khớp
Được thực hiện trên máy đếm tế bào máu Celltac F hãng Nihon Kohden tại Trung tâm Huyết học truyền máu Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên (nước sản xuất: Nhật Bản). Các giá trị bình thường được chuẩn hóa theo máy đang áp dụng tại khoa.
Đối với số lượng tế bào dịch khớp, đối tượng nghiên cứu sau đó được chia thành mỗi hai nhóm lần lượt ở ngưỡng 2000 tế bào/mm3 (nhóm <2000 và ≥2000 tế
bào/mm3) ngưỡng 50000 tế bào/mm3 ( nhóm ≤50000 và >50000 tế bào/mm3) và ngưỡng 85000 tế bào/mm3 (nhóm ≤85000 và >85000 tế bào/mm3) để tiến hành so sánh số lượng tế bào dịch khớp giữa các nguyên nhân [41, 60].
Đối với tỷ lệ bạch cầu đa nhân trung tính trong dịch khớp, đối tượng nghiên cứu cũng được chia thành hai nhóm ở các ngưỡng 50% (nhóm <50% và ≥50%) và ngưỡng 90% (nhóm ≤90% và >90%) để so sánh giữa các nguyên nhân [63].
2.4.5.3. Nhuộm soi dịch khớp
- Đánh giá hình thể, kích thước, tính chất bắt màu, cách sắp xếp của vi khuẩn và các hình ảnh tế bào (nếu có) bằng kỹ thuật nhuộm và soi dưới kính hiển vi quang học.
- Trang thiết bị và vật tư bao gồm: máy ly tâm (cần cho một số loại bệnh phẩm, tủ an toàn sinh học cấp 2, kính hiển vi quang học. Dụng cụ hóa chất, vật tư tiêu hao bao gồm: lọ lấy bệnh phẩm, que lấy, lam kính, dầu soi kính, cồn 90 độ, nước muối sinh lý, thuốc nhuộm đỏ fuchsin, thuốc nhuộm tím gentian, cồn tẩy 95 độ, lugol, thuốc nhuộm xanh methylene, bông, cồn 90 độ vệ sinh dụng cụ, đèn cồn, panh, khay đựng bệnh phẩm, hộp vận chuyển bệnh phẩm, mũ, khẩu trang, găng tay, quần áo bảo hộ, acid ngâm lam, ống nghiệm thủy tinh, bút viết kính, bút bi, bật lửa, sổ lưu kết quả xét nghiệm, cồn sát trùng tay nhanh, dung dịch nước rửa tay, khăn lau tay, giấy trả kết quả xét nghiệm.
- Quá trình nhuộm soi dịch khớp được tiến hành như sau: khởi động tủ an toàn sinh học ít nhất 15 phút trước khi thực hiện. Sắp xếp các dụng cụ cần thiết vào tủ an toàn sinh học. Chọn lam kính sạch, không xước. Hơ lam kính qua ngọn lửa đèn cồn để hủy chất dầu còn dính trên lam kính, để nguội lam tự nhiên. Đánh dấu tiêu bản bằng cách dùng bút chì đen HB ghi mã số bệnh phẩm lên đầu mờ lam kính. Quá trình dàn tiêu bản thực hiện trong tủ an toàn sinh học. Bệnh phẩm dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng 1cm. Ngâm que phết sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Jave 0,5%. Làm khô tiêu bản bằng cách đặt tiêu bản lên mâm kính và để tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (18-25°C). Quá trình cố định tiêu bản thực hiện bên ngoài tủ an toàn sinh học. Hơ nóng tiêu bản qua lại trên ngọn lửa đèn cồn 3-4 lần, mỗi lần 3 giây.
Quá trình nhuộm màu được thực hiện bằng cách đặt tiêu bản lên giá nhuộm, phủ đầy dung dịch tím gentians lên mặt phết tiêu bản đã được cố định, để trong 1 đến 2 phút. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Phủ dung dịch lugol 1 phút. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Tẩy màu bằng cồn 90◦ đến khi bạc màu 10 đến 30s. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ (lưu ý: không xối vòi nước thẳng vào vết dàn). Phủ thuốc nhuộm Fuchsin kiềm 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
- Đọc kết quả bởi bác sĩ chuyên khoa vi sinh: Đánh giá hình ảnh vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram. Soi tiêu bản bằng việc sử dụng kính hiển vi quang học vật kính dầu 100X theo hướng dẫn sử dụng kính hiển vi vật kính dầu mã hiệu VS.HD.03. Trong đó vi khuẩn Gram dương là vi khuẩn bắt màu tím sẫm của gentians. Vi khuẩn Gram âm là vi khuẩn bắt màu đỏ của fuchsin.
2.4.5.4. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn
- Quy trình nuôi cấy bệnh phẩm dịch khớp (theo Labo vi sinh Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên). Phương tiện bao gồm mẫu dịch khớp đã thu thập, tủ lạnh bảo quản sinh phẩm, tủ ấm thường, kính hiển vi, đèn cồn, que cấy, giá để bệnh phẩm, dầu soi, môi trường cấy thạch máu, các môi trường, hóa chất cho định danh vi khuẩn, bộ thuốc nhuộm Gram.
Tiến hành xét nghiệm: sát trùng bàn làm việc bằng cồn 70o. Đốt đèn cồn. Khử khuẩn que cấy 0,001 (1àl) trờn ngọn lửa, để nguội. Lắc nhẹ mẫu dịch khớp cho đều, cho que cấy 1àl chạm vào mẫu xột nghiệm theo chiều thẳng đứng. Lưu ý khụng nhúng cả que cấy vào sâu trong mẫu dịch khớp. Dùng que cấy đã lấy dịch khớp, vạch 1 đường giữa đĩa thạch, ria đường zig-zag gần nhau cắt ngang qua đường giữa, vạch những đường vuông góc với đường zig-zag. Đặt đĩa cấy vào tủ ấm 370C. Sau 18 -24h lấy đĩa đã nuôi cấy ra quan sát khuẩn lạc. Nếu không mọc khuẩn lạc theo dõi ít nhất 48h.
Nếu mọc khuẩn lạc: đếm số lượng và loại hình thể trên đĩa môi trường: vi khuẩn nuôi cấy <10 khuẩn lạc/đĩa: lượng vi khuẩn tương đương <104 CFU/ml. Vi khuẩn nuôi cấy có lượng từ 10 - 100 khuẩn lạc/đĩa: lượng vi khuẩn tương đương 104– 105 CFU/ ml. Vi khuẩn nuôi cấy có lượng >100 khuẩn lạc/đĩa: lượng vi khuẩn tương đương >105 CFU/ ml. Khi quá nhiều khuẩn lạc để đếm thì lượng tối đa >105
CFU/ml.
+ Nhuộm Gram khuẩn lạc. Soi vật kính x 100 có dầu soi để nhận định hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn: Nếu là cầu khuẩn tiến hành định danh theo quy trình định danh cầu khuẩn. Nếu là trực khuẩn tiến hành định danh theo quy trình định danh trực khuẩn.