CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Chỉ tiêu và phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định nguyên nhân và đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh thối gốc cây Ba kích trong giai đoạn vườn ươm tại tỉnh Quảng Ninh
a. Điều tra, thu thập mẫu bệnh thối gốc cây Ba kích trong giai đoạn vườn ươm tại Quảng Ninh
* ) Địa điểm và thời gian điều tra:
- Điều tra mẫu bệnh có nguồn gốc trong đất hại cây Ba kích được tiến hành tại 3 huyện là Ba Chẽ, Hoành Bồ và Tiên Yên. Thu thập 1 lần vào mùa mưa để xác định tác nhân gây bệnh, do mùa này tỷ lệ bệnh biểu hiện cao nhất.
- Thời gian điều tra: Tháng 10/2022.
*) Phương pháp điều tra và thu thập:
Việc điều tra được tiến hành theo “Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng” của Viện Bảo vệ thực vật (1997) và Quy chuẩn Quốc gia QCVN-01-38:2010/BNNPTNT ngày 12/10/2010 của Bộ Nông nghiệp và PTNT về điều tra và phát hiện dịch hại trên cây trồng.
Trong quá trình điều tra tiến hành quan sát, ghi chép các triệu chứng của các loại bệnh hại, thu thập riêng rẽ từng đối tượng cho vào túi thu mẫu chứa hóa chất loại trừ độ ẩm và ghi đầy đủ các thông tin cần thiết như cây kí chủ, vị trí bị hại, triệu chứng cây bị hại, tọa độ thu mẫu, ngày thu mẫu, người thu mẫu. Cho các mẫu thu
thập vào thùng mát có chứa đá gel mang về phòng thí nghiệm. Các loại bệnh hại sẽ được phân lập, nuôi cấy, làm thuần phục vụ công tác giám định tác nhân gây bệnh.
Ngoài các điểm điều tra cố định, tiến hành điều tra bổ sung ở các điểm khác được thực hiện vào các giai đoạn phát triển khác nhau của cây Ba kích tùy thuộc vào quy luật phát sinh và gây hại của các loại bệnh.
Đánh giá mức độ phổ biến của bệnh thối gốc trên cây Ba kích theo phương thang phân cấp sau.
+ : <10% cây bị bệnh : Không phổ biến ++ : 11 – 25% cây bị bệnh : Ít phổ biến +++ : 26 – 50% cây bị bệnh : Phổ biến ++++ : > 50% cây bị bệnh : Rất phổ biến
*) Chỉ tiêu theo dõi:
- Tỷ lệ cây bị hại được tính theo công thức sau:
Tỷ lệ bệnh (%) = Tổng số cây bị hại X 100 Tổng số cây điều tra
b. Xác định nguyên nhân gây bệnh thối gốc cây Ba kích trong giai đoạn vườn ươm - Thời gian thực hiện: tháng 11/2022 – 12/2023.
- Địa điểm thực hiện: Viện Bảo vệ thực vật Hà Nội.
*) Phân lập tác nhân gây bệnh thối gốc:
Tổng số mẫu bệnh thu từ mục a (thu thập, điều tra mẫu) sẽ được phân loại thành từng nhóm triệu chứng khác nhau, phân lập, xác định tác nhân gây bệnh bằng việc thực hiện đồng bộ các phương pháp như sau:
Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước sau đó đặt mẫu bệnh vào hộp Petri có giấy thấm vô trùng bổ sung nước cất vô trùng để tạo độ ẩm. Sau 1 - 2 ngày, tiến hành quan sát đặc điểm hình thái của nấm mọc ra từ mô bệnh dưới kính lúp soi nổi và kính hiển vi chuyên dụng.
Các rễ con mảnh, nhỏ, và các rễ phụ làm nhiệm vụ hấp thụ dinh dưỡng cho sự phát triển của cây và quan trọng cho sức khỏe của cây. Phân lập nấm từ rễ mảnh,
nhỏ được thực hiện theo các bước sau: Chọn những rễ con có cả phần khỏe (không triệu chứng) và phần bị bệnh, rửa chúng bằng nước vô trùng đựng trong lọ nhỏ, thay nước 3 lần. Thêm một giọt thuốc tẩy vào lọ trong lần rửa đầu tiên. Nhúng qua các rễ con trong cồn ethanol 70%, rửa nhanh trong nước vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng. Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt rễ thành từng miếng dài 1 - 2mm ở phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh sau đó cấy lên môi trường WA (Water agar) chứa kháng sinh. Ấn nhẹ các miếng cấy lên mặt thạch sao cho chúng tiếp xúc tốt với kháng sinh trong môi trường phân lập. Sau một đến hai ngày, tiến hành làm thuần nấm bằng phương pháp cấy đỉnh sinh trưởng của sợi nấm mọc trên môi trường WA và chuyền sang môi trường PDA. Đặt đĩa cấy ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (khoảng 25oC) và quan sát hàng ngày dưới kính lúp soi nổi để kiểm tra nấm mọc từ các mẫu rễ nuôi cấy.
Tiến hành sàng lọc và lựa chọn những nguồn nấm có đặc điểm hình thái tản nấm tương đồng nhau. Kết quả đã lựa chọn được 04 chủng nấm từ đại diện cho các mẫu phân lập được từ 120 mẫu bệnh thu thập từ các vùng trồng Ba kích của, ký hiệu QN1 và QN2 từ huyện Ba Chẽ, chủng QN3 từ huyện Tiên Yên và QN4 từ huyện Hoành Bồ.
*) Lây bệnh nhân tạo
Sau khi làm thuần 4 chủng nấm QN1, QN2, QN3 và QN4, tiến hành nhân nuôi sinh khối nấm và lây nhiễm nhân tạo bằng dịch bào tử từng nguồn nấm khác nhau với nồng độ bào tử 5 × 106 bào tử/ml. Cây Ba kích con 1 năm tuổi sản xuất bằng kỹ thuật nhân giống bằng hom đồng đều nhau về khả năng sinh trưởng, trồng bằng đất đã được hấp khử trùng trong điều chậu vại. Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo được tiến hành theo 2 phương pháp bao gồm (i) gây sát thương và (ii) không gây vết thương lên phần gốc, thân của cây Ba kích con. Đối với công thức đối chứng, cây Ba kích được lây nhiễm bằng nước cất vô trùng theo phương pháp không gây vết thương. Mỗi chủng nấm được lây nhiễm trên 30 cây, nhắc lại 3 lần. Số cây đối chứng: 30 cây (cho phương pháp gây vết thương) và 30 cây (không gây vết thương).
Quan sát thời gian xuất hiện của triệu chứng bệnh vàng lá trên các cây thí nghiệm, mô tả so sánh với triệu chứng bệnh trên đồng ruộng, tính tỷ lệ cây bị bệnh.
Tiến hành tái phân lập nấm từ các cây lây bệnh nhân tạo có biểu hiện triệu chứng
bệnh giống với các triệu chứng bệnh trên đồng ruộng và so sánh với loài nấm đã sử dụng trong thí nghiệm lây bệnh nhân tạo.
*) Phương pháp định danh loài nấm gây bệnh bằng phương pháp hình thái và kỹ thuật phân tử
Những chủng nấm sau khi lây bệnh nhân tạo có biểu hiện triệu chứng sẽ được tái phân lập và làm thuần sau đó cấy trên các môi trường khác nhau như CLA, PDA. Phân loại các loại nấm dựa theo khóa phân loại của Whittaker (1969) thực hiện bao gồm hình thái học, cơ quan sinh sản, dạng bào tử, đặc điểm sinh học, tốc độ phát triển, khả năng sinh bào tử để phân loại nấm. Tiến hành làm tiêu bản lam để lưu giữ các loài nấm đã được phân loại.
Để phân loại các đối tượng nấm gây bệnh thành các chi nấm khác nhau, tiến hành xác định và phân tích đặc điểm triệu chứng, mô tả đặc điểm hình thái của các cơ quan sinh sản của nấm dưới kính hiển vi dựa theo một số tài liệu phân loại như:
Đặng Vũ Thị Thanh và cs., 2001, 2006; Barnett và Hunter, 1998; Burgess và Nelson, 1985; Cummins và Hiratsuka, 1996; Ellis, 1976; Erwin và Ribeiro, 1996;
Hanlin, 1992; Roger, 1951, 1953, 1954; Sutton, 1980, 1992; và Singh, 1991.
Vì trong cùng một chi, các loài nấm thường có các đặc điểm các cơ quan sinh sản tương tự nhau, dẫn đến khó phân loại một cách chính xác. Do đó, song song với phương pháp xác định tên khoa học của nấm theo đặc điểm hình thái, tiến hành xác định tên khoa học của nấm bằng kỹ thuật PCR và phân tích trình tự DNA.
Tiến hành chiết suất DNA tổng số bằng phương pháp sử dụng DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) hoặc bằng CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) theo mô tả của Doyle & Doyle (1990). DNA của các mẫu nấm được khuếch đại bằng cặp mồi W106R (5’-GCAGTCGTACGTCATCGACC-3’) và W106S (5’- CCATGGCAGATGGCGAGTCA-3’), đây là cặp mồi chung đặc hiệu chuyên sử dụng để phát hiện và phân loại loài nấm Fusarium oxysporum (Li và cs., 2021).
Quy trình phản ứng PCR gồm: 94°C trong 5 phút, 35 chu kỳ tại 94°C trong 30 giây, 63°C trong 30 giây, 72°C trong 1 phút, và cuối cùng 72°C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong 1×TAE buffer có chứa dung dịch nhuộm Redsafe và chụp ảnh bằng máy Gel Doc™ XR+ System.
Sản phẩm PCR được tinh sạch từ agarose gel sử dụng Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Mỹ) và được giải trình tự gen trực tiếp cả hai chiều bằng các mồi sử dụng trong phản ứng PCR tương ứng trên máy ABI3100 sử dụng BigDye Terminator 3.1 Kit (Applied Biotech). Trình tự các mẫu được so sánh với Ngân hàng Gen bằng phần mềm trực tuyến http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (Altschul và cs, 1990). Cây phả hệ xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining với khoảng cách di truyền giữa các chuỗi được xác định dựa trên mô hình thay thế Kimura hai tham số, giá trị thống kê bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại trong phần mềm MEGA X (Kumar và cs., 2018).
c. Xác định đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh thối gốc cây Ba kích trong giai đoạn vườn ươm
*) Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau:
Tiến hành nghiên cứu, đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau. Nấm được làm thuần và nuôi cấy trên 4 môi trường nhân tạo: WA (Water Agar), PDA (Potato Dextrose Agar), CDA (Czapek Dox Agar) và YMA (Yeast Mannitol Agar). Mỗi loài nấm được được đánh giá một cách độc lập bằng cách nuôi cấy trên 4 loại môi trường trên đĩa Petri Φ = 9cm với 3 lần nhắc lại ở điều kiện nhiệt độ phòng 25oC. Mỗi một loại môi trường là một công thức thí nghiệm, được nhắc lại 5 lần, mỗi lần nhắc lại là 1 đĩa Petri. Hàng ngày, theo dõi tốc độ phát triển của nấm, đo đường kính tản nấm sau khi cấy 2, 5, và 7 ngày hoặc đến khi nấm mọc chạm mép đĩa tùy thuộc vào khả năng sinh trưởng và phát triển của từng loài nấm cụ thể.
*) Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh ở các mức nhiệt độ khác nhau trên môi trường PDA:
Nấm gây bệnh sau khi phân lập trên môi trường WA, được tiến hành nuôi cấy trên môi trường PDA trên đĩa Petri Φ = 9cm, với 3 lần nhắc lại ở điều kiện nhiệt độ 20, 25, 28, 30 và 35 oC. Mỗi mức nhiệt độ là một công thức thí nghiệm, mỗi công thức được nhắc lại 5 lần, mỗi lần 1 đĩa Petri. Hàng ngày, theo dõi tốc độ phát triển
của nấm bằng cách đo đường kính tản nấm sau khi cấy 2, 5, và 7 ngày hoặc đến khi nấm mọc chạm mép đĩa. Theo dõi thời gian từ khi cấy đến khi nấm mọc kín đĩa và sự xuất hiện của hạch nấm (nếu có).
*) Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và phát triển của tác nhân gây bệnh ở các mức pH khác nhau trên môi trường PDA
Từ thí nghiệm ở trên, chọn mức nhiệt độ phù hợp nhất đối với sự phát triển của nấm để tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện pH 5,0; 5,5; 6,0; 6,5;
7,0; 7,5 và 8,0. Chỉ tiêu theo dõi: đường kính của tản nấm ở các thời điểm sau khi cấy 2, 5 và 7 ngày. Theo dõi thời gian từ khi cấy đến khi nấm mọc kín đĩa và sự xuất hiện của hạch nấm (nếu có).