1.3. KHÁI QUÁT VỀ BỘ KÍT FORENSEQ DNA SIGNATURE PREP -
1.4.2. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới MiSeq FGx TM của hãng Illumina -
Công nghệ giải trình tự thế hệ mới là một bước đột phá tiếp theo, đang trở thành một công cụ phân tích quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử nói chung và giám định ADN hình sự nói riêng với những cải tiến ưu việt sau [21]:
- Công nghệ mới không yêu cầu tách dòng các đoạn ADN, mà thay vào đó là việc chuẩn bị các thư viện NGS.
- Thay vì hàng trăm phản ứng giải trình tự thì công nghệ mới có thể đồng thời thực hiện được hàng triệu phản ứng giải trình tự, do đó hàng triệu hoặc hàng tỉ phân tử ADN có thể được giải trình tự đồng thời.
- Trình tự được đọc trực tiếp mà không cần phải điện di. Số lần đọc của NGS là vô cùng lớn, có thể giải trình tự toàn bộ hệ gen trong thời gian ngắn, do đó có thể ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và đời sống.
Hình 1.3. Quy trình giải trình tự thế hệ mới của Illumina [19]
Hệ thống máy giải trình tự của hãng Illumina sử dụng công nghệ giải trình tự theo phương pháp tổng hợp (Sequencing by Synthesis) kết hợp với việc sử dụng các nucleotide có gắn tín hiệu huỳnh quang và khóa dừng thuận nghịch để đọc và nhận biết trình tự một cách trực tiếp. Nguyên tắc của công nghệ cũng giống với giải trình tự bằng điện di mao quản. ADN polymerase xúc tác cho quá trình ghép các deoxyribonucleotide triphosphates được gắn huỳnh quang vào mạch khuôn ADN trong suốt các chu trình tổng hợp. Trong suốt mỗi chu trình, tại nucleotit có sự kết hợp sẽ được phát hiện bằng các bức
Chuẩn bị thư viện
Tạo Cluster
Giải trình tự
xạ huỳnh quang. Điểm khác biệt chính là thay vì chỉ giải trình tự trên 1 sợi ADN, công nghệ NGS của hãng Illumina giải trình tự nhiều đoạn ADN cùng một lúc. Công nghệ giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS) sẽ đưa ra kết quả có độ chính xác cao, tăng tỉ lệ đọc được của các đoạn ADN [19].
Hệ thống MiSeq FGx là hệ thống được hãng Illumina phát triển riêng cho giám định ADN hình sự. Hệ thống được ra mắt vào tháng 01 năm 2015 được đánh giá là một giải pháp hoàn chỉnh cho lĩnh vực khoa học hình sự.
Với những đặc điểm như:
- Chỉ sử dụng một bộ kit duy nhất nhưng phân tích được cả 2 nhóm chỉ thị ADN trong hình sự là STRs và SNPs. Từ đó cung cấp được lượng thông tin rất lớn, mang độ tin cậy và chính xác cao.
- Kết hợp đồng thời các STR trên nhiễm sắc thể thường (27 locus), nhiễm sắc thể giới tính Y (25 locus) và nhiễm sắc thể giới tính X (7 locus).
Bên cạnh đó còn có tổ hợp 94 SNPs mang thông tin giúp phân biệt cá thể.
- Kích thước của các đoạn amplicon sau khi khuếch đại từ 60 – 460bp, do đó có thể phân tích các mẫu ADN bị đứt gãy, các mẫu có chất lượng kém.
- Có khả năng dự đoán được kiểu hình và nguồn gốc chủng tộc của cá thể do có tổ hợp các ancestry SNPs và phenotyping SNPs.
- Có thể phân tích đồng thời 96 mẫu.
Quy trình giải trình tự gồm có 4 bước chính:
- Bước 1: Chuẩn bị thư viện (Library Preparation)
Bao gồm việc chuẩn bị thực hiện theo quy trình của bộ kit ForenSeq ADN Signature Prep. Mẫu sẽ được khuếch đại những đoạn ADN đặc hiệu và gắn thêm các adapter riêng biệt để có thể phân biệt giữa các mẫu với nhau.
Cuối cùng, các mẫu sẽ được trộn lại chung và đưa vào máy giải trình tự.
- Bước 2: Tạo Cluster
Thư viện sau khi được chuẩn bị sẽ được máy đưa tự động lên flow cell - nơi có các đoạn nhỏ oligo nucleotit đã được gắn lên trên bề mặt có sự tương thích với các adapter. Mỗi đoạn sẽ khuếch đại riêng biệt và tách thành từng
nhóm cluster thông qua phản ứng khuếch đại đường cầu. Sau quá trình tạo ra các Cluster thì mạch khuôn đã sẵn sàng cho việc giải trình tự.
- Bước 3: Giải trình tự bằng công nghệ tổng hợp. Kết quả có độ chính xác đến từng base.
- Bước 4: Phân tích kết quả.
Hệ thống có server đi kèm sử dụng phần mềm riêng biệt để phân biệt và so sánh các mẫu với nhau.