CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Húng quế
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan phương pháp thực hiện dựa theo tác giả Tôn Long Dày (2013). Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt,...
Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu.
60
Màu sắc và độ trong suốt
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm,...). Nếu tinh dầu vẫn còn đục, không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
Mùi
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu, mỗi một loại tinh dầu đều có một một mùi đặc trưng riêng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc,...).
Vị
Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu, mỗi một loại tinh dầu cũng có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng,…) và cường độ của vị (dịu, thoảng,…).
2.3.4.1. Xác định chỉ số vật lý Định lượng tinh dầu:
Theo (TCVN 8444:2010) hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức:
% Tinh dầu =số ml tinh dầu thu được sau chưng cất
số g nguyên liệu tươi hoặc héo × 100%
Tỷ trọng tinh dầu húng quế
Tỷ trọng của tinh dầu tại 20ºC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 20ºC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 20ºC.
Do hàm lượng tinh dầu thu được ở mỗi lần chưng cất rất thấp, các phương pháp bảo quản chưa được tối ưu dẫn đến việc tinh dầu bị quang hóa, oxy hóa có thể ảnh hưởng đến kết quả đo tỷ trọng. Vì vậy việc sử dụng bình tỷ trọng 10ml không phù hợp, thay vào đó tỷ trọng được thực hiện theo phương pháp thủ công.
Dùng ống tiêm y tế (1 ml), trên thân ống tiêm được vạch một đường làm dấu.
Cách xác định:
61
– Ban đầu, đem cân ống tiêm không và ghi số liệu lại (m0).
– Tiếp theo: hút nước cất đến vạch (lưu ý trong ống tiêm không có bong bóng khí), đem cân và ghi lại số liệu (m1). Rồi xả bỏ nước trong ống tiêm vẩy cho khô nước.
– Cuối cùng: hút tinh dầu khan đến vạch (lưu ý không để cho có bong bóng khí trong ống tiêm) đem cân và ghi lại số liệu (m2).
– Theo (TCVN 189:1993), tỷ trọng tinh dầu được tính theo công thức sau:
𝐝𝟐𝟎𝟐𝟎 = 𝐦𝟐−𝐦𝟎 𝐦𝟏−𝐦𝟎
Trong đó: m0: khối lượng của ống tiêm không, tính bằng
m1: khối lượng của ống tiêm và nước cất, tính bằng gam (g).
m2: khối lượng của ống tiêm và tinh dầu, tính bằng gam (g).
– Cứ như thế lặp lại nghiệm thức 3 lần: d (tb) = (d1 + d2 + d3)/3 Độ hòa tan của tinh dầu trong ethanol.
– Pha cồn 90º, 80º, 70º từ cồn tuyệt đối.
– Dùng pipette chuẩn hút 1 ml tinh dầu Húng quế cho vào bình tam giác có nút mài. Từ buret nhỏ dần ethanol vào bình đựng tinh dầu. Sau mỗi lần nhỏ khoảng 0,2 ml vào đậy nút, lắc đều cho đến khi tan hết tinh dầu. Tiếp tục nhỏ ethanol vào và lắc cho đến khi thu được dung dịch đồng nhất trong suốt, ghi lượng ethanol đã dùng.
– Lặp lại thao tác 3 lần.
2.3.4.2. Xác định chỉ số hóa học Chỉ số acid (Index acid)
Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hoà các acid tự do trong 1 g tinh dầu, KOH trung hoà các acid tự do trong tinh dầu theo phản ứng:
RCOOH + KOH → RCOOK + H2O Cách xác định:
– Cho vào erlen 100 ml: 10 ml ethanol, thêm vào 5 giọt dung dịch chỉ thị phenolphthalein. Cho tiếp 1 g tinh dầu (± 0,005 g), lắc đều cho dầu tan hoàn toàn. Tiếp tục chuẩn độ dung dịch bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi xuất
62
hiện màu hồng bền trong 30 giây. Ta thực hiện phép đo 3 lần, ghi lại thể tích dung dịch KOH 0,1N (VKOH) dùng chuẩn độ, lấy kết quả trung bình.
– Theo (TCVN 189:1993), chỉ số acid được tính theo công thức:
𝐈𝐀 =𝟓, 𝟔𝟏. 𝐕 𝐦
Trong đó: VKOH: số ml dung dịch KOH 0,1N dùng chuẩn độ 5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0,1N m: số g tinh dầu dùng để chuẩn độ
Chỉ số ester (Index Ester)
Chỉ số ester hoá của tinh dầu là số mg KOH cần thiết để trung hoà lượng acid béo nằm ở dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
Cách xác định:
– Dùng burett cho 20 ml dung dịch KOH 0,5N vào erlen để xà phòng hóa có chứa lượng mẫu đã xác định chỉ số acid ở trên lắp ống sinh hàn ngược vào bình đun cách thủy trong 1 giờ đến khi phản ứng xà phòng hóa kết thúc (lúc đó dung dịch trong bình màu hồng, đồng thời xuất hiện tinh thể nhỏ màu vàng nâu).
– Đồng thời làm một mẫu đối chứng với 20 ml dung dịch KOH 0,5N trong ethanol và 10 ml ethanol 96º, tiến hành trong cùng điều kiện như trên.
– Đun xong để nguội cho vào 2 erlen mỗi erlen 5 giọt chỉ thị màu phenolphetalein 2%, chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,1N. Hiệu số giữa số ml dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu đối chứng và số ml dung dịch HCl 0,1N đã dùng trong mẫu thử là số ml HCl đã dùng để trung hòa lượng KOH dùng cho phản ứng este hóa.
– Theo (TCVN 189:1993), chỉ số ester được tính theo công thức:
𝐈𝐄 =𝟓, 𝟔𝟏. (𝐕𝟏− 𝐕𝟎) 𝐦
Trong đó: V0: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu trắng (ml) V1: thể tích dung dịch HCl dùng cho mẫu tinh dầu (ml) 5,61: số mg KOH có trong 1 ml dung dịch KOH 0,1N m: số g tinh dầu bạch đàn
63
Chỉ số savon hoá (Index Savon)
Chỉ số aavon hoá là số mg KOH cần thiết để tác dụng với tất cả các acid tự do và acid kết hợp dưới dạng ester có trong 1 g tinh dầu.
Quá trình savon hoá tinh dầu bao gồm:
– KOH trung hoà các acid tự do: KOH + RCOOH → RCOOK + H2O – KOH xà phòng hoá các ester: KOH + R1COOR2 → R1COOK +R2OH
Theo (TCVN189:1993), chỉ số savon hoá của tinh dầu bằng tổng số giữa chỉ số ester hoá và chỉ số acid:
IS = IE + IA
Trong đó: IS: chỉ số savon hoá IE: chỉ số ester hoá
IA: chỉ số acid hoá 2.3.4.3. Xác định thành phần hóa học của tinh dầu
Thành phần hoá học của tinh dầu Húng quế được xác định bằng phương pháp sắc kí ghép khối phổ GC/MS với các điều kiện như sau:
– Máy sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS: HP6890
– Cột mao quản: dài 30 m, đường kớnh trong 250 àm, lớp phim dày 250 àm.
– Nhiệt độ phần bơm mẫu (injector): 250ºC – Tỷ lệ dòng (splitless)
– Đầu do khối phổ tứ cụ (MSD)
– Tốc độ dòng khí mang (He) 0,9 ml/phút, áp suất 6,9 psi.
Chương trình nhiệt phân tích: bắt đầu ở 60ºC, giữ trong 4 phút. Sau đó tăng lên 100oC, với tốc độ tăng 10ºC/phút. Tiếp tục tăng đến 280ºC với tốc độ tăng 30ºC/phút và giữ trong 15 phút (Phùng Thị Ái Hữu, 2012).
Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu Húng quế tại Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh (số 01 Mạc Đĩnh Chi, quận 1, TP. Hồ Chí Minh) trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ.
Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghị được
64
tính bằng đại lượng độ tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn giống với phổ khối của một chất chuẩn trong thư viện thì độ tương thích là được biểu thị là 1000. Độ tương thích đạt trên 800 được xem là cho kết quả có độ tin cậy cao.