2.1 ˆ Nguyên liệu
2.1.1 ChẾphẩm enzyme
Các chế phẩm amylase dùng trong nghiên cứu này là chế phẩm thương mai do hãng Novozymes (Đan Mạch) sản xuất và được cung cấp bởi Công ty trách nhiệm hữu
han Brenntag Việt Nam thuộc tập đoàn Brenntag (Duc), địa chỉ: 202 Hoang Văn Thu,
phường 09, quận Phú Nhuận thành phố Hồ Chí Minh.
Chế phẩm enzyme ơ — amylase có tên thương mai là Termamyl 120L. Đây là chế phẩm chứa a — amylase bền nhiệt có xuất xứ từ canh trường vi khuẩn Bacillus licheniformis. Điều kiện hoạt động thích hợp của chế phẩm là 85°C — 95°C, pH 6,0 — 7,0. Chế phẩm có hoạt độ 120 KNU/g (Kilo Novo Unit). Một KNU được hãng Novozymes định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân 5,26 g tinh bột hòa tan trong một giờ trong điều kiện pH 5,6 và nhiệt độ 37°C theo phương pháp chuẩn
của Novozyme (Termamyl® 120 L, Type L Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005).
Chế phẩm enzyme glucoamylase có tên thương mai là Dextrozyme GA. Đây là chế phẩm chứa glucoamylase có xuất xứ từ canh trường nắm mốc Aspergillus niger.
Điều kiện hoạt động thích hợp của chế phâm là 60°C — 65°C, pH 4,0 — 5,0. Chế phẩm
có hoạt độ 270 AGU/g (AmyloGlucosidase Unit). Một AGU được định nghĩa là lượng
enzyme cần thiết dé xúc tác thủy phân ra 1 mol đường glucose trong 1 phút ở điều kiện nông độ cơ chất 10 mg/mL; nhiệt độ 37°C; pH 5,0; thời gian phan ứng 30 phút
(Dextrozyme® GA Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005).
2.1.2 Tinh bot khoai mi
Tinh bột khoai mi được tài trợ boi Công Ty Ajinomoto Việt Nam. Tinh bột có độ
âm 13 + 0,5%. Ham lượng tinh bột 86 + 0,5%. Kích thước trung bình của hạt tinh bột khoai mì là 41um. Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa và nhiệt độ đạt đỉnh nhớt của dung dịch tinh
bột 5% tương ứng là 65°C và 75°C.
_ 28 -
2.1.3 Các hóa chat phân tích
Các hóa chất phân tích gồm tinh bột hòa tan, maltodextrin DE 20, thuốc thử DNA 3,5 — dinitrosalicylic acid, thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, hệ đệm natri phosphate và hệ đệm citrate phosphate do hãng Merck (Đức) sản xuất.
2.2 Nội dung nghiên cứu
Khi sóng siêu âm tác động vào hỗn hợp nước, tinh bột và enzyme, hiện tượng xâm thực có thể tác động đến cau trúc của hạt tinh bột và hoạt độ của enzyme. Dé có thé hiểu rõ ảnh hưởng của sóng siêu âm đến từng nhóm cầu tử của hỗn hợp, luận án được chia thành 4 phan: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì; Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase; Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tỉnh bột khoai mì có chứa enzyme
và so sánh hiệu quả của các giải pháp làm tăng hiệu quả thủy phân.
Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tỉnh bột khoai mì — Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa: Mục đích của phần này nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng amylose và amylopectin ra khỏi hạt tinh bột, làm tăng
độ hòa tan tinh bột khi không có enzyme xúc tác.
Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ và tính chất của hai chế phẩm Termamyl 120L và
Dextrozyme GA khi không có mặt tinh bột
Phan 2.1. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L
— Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ a- amylase của chế phẩm Termamyl 120L:
Xác định quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm.
— Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Termamyl 120L: Xác định và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng: trong đó, chế phẩm Termamyl 120L có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm, và chế phẩm Termamyl 120L ban đầu được gọi tat là mẫu đối chứng. Nội dung khảo sát bao gồm: biến đôi hoạt độ a — amylase theo pH và nhiệt độ: các thông số động
học và nhiệt động học cua phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan có enzyme xúc tac và các thông sô nhiệt động của quá trình vô hoạt enzyme.
_20-
Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Dextrozyme GA
— Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác định quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm.
— Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác định và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng: trong đó, chế phẩm Dextrozyme GA có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm, và chế phẩm Dextrozyme GA ban đầu được gọi tắt là mẫu đối chứng. Nội dung khảo sát bao gồm: biến đối hoạt độ glucoamylase theo pH và nhiệt độ.
Phan 3: Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme — Anh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa: Mục đích của phần này nhăm xác định quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng và thủy phân tỉnh bột, làm tăng hàm lượng tinh bột hòa tan trong hỗn hop tinh bột và enzyme.
Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả thủy phân tinh bột khoai mi: sử dung enzyme có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm để xúc tác cho quá trình thủy phân và sử dụng sóng siêu âm để xử lý hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì và enzyme trong giai đoạn dịch hóa. Thông số so sánh là hiệu suất thủy
phân tinh bột sau hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa; lượng enzyme sử dụng và năng
lượng siêu âm cần sử dụng dé tăng thêm 1g đường khử so với mẫu đối chứng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
2.3.1 Phương pháp cổ điển
Chúng tôi thay đối giá trị một thông số cần khảo sát, cố định giá trị các thông số còn lại, từ đó xác định quy luật bién đối của hàm mục tiêu theo thông số khảo sát.
2.3.2 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Chúng tôi thay đổi đồng thời các thông số cần khảo sát theo ma trận quy hoạch thực nghiệm phương án quay bậc hai có tâm của Box — Hunter nhằm đánh giá ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm mục tiêu và xác định giá trị của các yếu tổ dé hàm
mục tiêu đạt giá trị cực đại.
- 30 -
2.4 Bồ trí thí nghiệm
2.4.1 Phan 1: Xử lý siêu âm huyén phù tinh bột khoai mì — Ảnh hưởng của sóng
siêu âm đên giai đoạn hồ hóa
— Mục đích: xác định quy luật ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu và các thông số nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm đến độ hòa tan tỉnh bột trong giai đoạn hồ hóa.
— Cách thực hiện: Dựa vào các kết quả tham khảo trong phân tổng quan (Bảng 1.4) và các kết quả thí nghiệm sơ bộ, các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa được tiễn hành như sau: 100 gram tinh bột khoai mì được hòa với nước cất với các thé tích khác nhau. Hỗn hợp huyền phù được gia nhiệt trong thiết bị phản ứng đến một giá trị nhiệt độ xác định. Các “mẫu siêu âm” được xử lý với thời gian và công suất siêu âm được cài dat san. Quá trình siêu âm được thực hiện trong thiết bị phản ứng có hệ thống điều nhiệt sao cho nhiệt độ các mẫu xử lý không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát. Các “mẫu đối chứng” được ủ trong thiết bị phản ứng ở nhiệt độ tương đương với các “mẫu siêu âm”. Sau đó, cả mẫu siêu âm và đối chứng đều được gia nhiệt lên đến 90°C và ủ ở nhiệt độ này sao cho tong thoi gian hồ hóa (gồm thời gian xử lý nhiệt va siêu âm) là 60 phút. Mẫu phân tích được lay ở thời điểm bắt đầu siêu âm, kết thúc siêu âm và sau mỗi 10 phút trong suốt quá trình thí nghiệm để xác định hàm lượng tinh bột hòa tan, từ đó xác định phương trình động học mô tả độ hòa tan tinh bột theo thời gian hồ hóa. Bên cạnh đó, để giải thích ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ hòa tan tỉnh bột trong các thí nghiệm 1.2 (Bảng 2.1), tiễn hành xác định sự biến thiên độ nhớt của huyền phù tinh bột khoai mì theo sự gia tăng nhiệt độ trong giai đoạn hồ hóa.
— Bồ trí thí nghiệm: Các thí nghiệm sẽ được bố trí theo phương pháp cô điển. Các yếu tố có định va thay đối được trình bày trong Bang 2.1.
— Kết quả dự kiến: xác định được quy luật ảnh hướng của các yếu tô nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột sau 60 phút hỗ hóa và tại thời điểm cân băng.
-31-
Bảng 2.1. Bồ tri thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tô trong quá trình xử lý
siêu âm dén hàm lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hô hóa TNI1 Yếu tô thay doi Yếu tô cỗ định
5 10- 15- 20 — 25 - 30 - 35% ne Suet sien ame 2 0 6 ims- Thời gian siêu âm: 10 phút
50 - 60 - 64 - 65 - 70 — 75 — 77 ns Suat sieu ame ở 0 6 ams- Thời gian siêu âm: 10 phút Cụng suất siờu õm (W/ứ tinh bột) | 7 Nụng độ huyền phự tớnh bột: được chọn từ kờt quả TNI.I 1.3 - Nhiệt độ bat đâu siêu âm: được chọn từ kêt quả TN1.20-1,5-—2,25-3,0-3,75-45 Sareea ,
- Thời gian siêu âm: 10 phút ve. ơ , - Nụng độ huyện phự tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1
1.4 an ream tpn - Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: được chọn từ kết qua TN1.2
- Công suât siêu âm được: chọn từ kêt quả TN1.3
2.4.2 Phan 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase
Dựa vào các kết quả tham khảo trong phan tong quan (Mục 1.4.1.2) và các kết quả thí nghiệm sơ bộ, các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính và tính chất chế phẩm enzyme amylase được tiễn hành như sau:
2.4.2.1 Phần 2.1. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L
a. Anh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ a- amylase của chế phẩm
Termamyl 120L
— Mục đích: xác định quy luật biến đối hoạt độ a - amylase của chế phẩm Termamyl 120L khi thay đôi các thông số nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm.
— Cách thực hiện: 15 mL chế phẩm enzyme được cho vào cốc thủy tỉnh để xử lý siêu âm với thời gian và công suất được cài đặt sẵn. Trong quá trình siêu âm, cốc đựng mẫu được đặt trong bể nước lạnh dé điều nhiệt sao cho nhiệt độ mẫu không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát. Sau quá trình siêu âm, các mẫu enzyme được đem xác định hoạt độ amylase và so sánh hoạt độ với các mẫu đối chứng. Các “mẫu đối chứng” được ủ trong bé điều nhiệt ở nhiệt độ va thời gian tương đương với các “mẫu siêu âm”. được không xử lý siêu âm. Để giải thích nguyên nhân sóng siêu âm làm thay đôi hoạt tinh amylase trong mẫu siêu âm, mẫu enzyme siêu âm có hoạt độ a — amylase tăng cao nhất và mẫu enzyme đối chứng được đem di xác định hàm lượng protein hòa tan, thành phan protein theo phân tử lượng, phố UV, phố hồng ngoại và phố cộng hưởng từ hạt nhân.
_32-
— Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bồ trí theo phương pháp cô điển và quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai có tâm của Box — Hunter. Các thông yếu tố cô định và thay đôi được trình bay trong Bang 2.2.
Bang 2.2. Bồ trí thí nghiệm theo phương pháp cô điển về ảnh hưởng của các yếu tổ xử
lý siêu âm đền hoạt độ amylase của chê phầm enzyme thương mai
TN2.1 Yếu tô thay doi Yếu tô cỗ định 211 Nhiệt độ siêu âm (°C) - Công suat siêu âm: 20W/mL chê phâm
xa 20 — 30 - 40 - 50— 60 - Thời gian siêu âm: 60 giây
21.2 Công suât siêu âm (W/mL chế phâm) - Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1
a 0-—10- 15-—20-— 25-30-35 - Thời gian siêu âm: 60 giây
Thời gian siêu âm (giây) 2.1.3 0-30-45 —- 60-— 75 — 90 — 105 — 120-—
135 — 150
— Kết qua dự kiên: xác định được quy luật anh hương cua các yêu tô xử ly siêu âm dén
- Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1
- Công suât siêu âm: được chọn từ két quả TN2.1.2
hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L; chọn được các yếu tô xử lý siêu âm dé hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L đạt giá trị cao nhất.
b. Anh hưởng của sóng siêu âm đến tính chat của chế phẩm Termamyl 120L
Sử dung các yếu tô xử lý siêu âm đã tìm được ở mục 2.4.2.1.a dé làm tăng hoạt tính xúc tác của chế phẩm Termamyl 120L. Chế phẩm nay được gọi tắt là enzyme siêu âm. Trong các thí nghiệm tiếp theo, tinh chất của chế phẩm enzyme siêu âm sẽ được so sánh với chế phẩm “enzyme đối chứng” (không qua siêu âm).
i. pH toi ưu và các thông số động hoc enzyme e Mục dich: xác định và so sánh ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của hai chế
phẩm enzyme siêu âm và đối chứng e Cách thực hiện: Mỗi mẫu thí nghiệm được dem đi xác định hoạt độ amylase và các
thông số động hoc (Vmax, Km, Keat, Kea/Km) khi thay đổi giá trị pH từ 5,0 đến 9,0, nhiệt độ được 6n định ở 85°C. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện pH khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phân trăm so với điều kiện pH cho hoạt độ cao nhất.
e Kết quả dự kiến: xác định được quy luật ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng và giá trị pH tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng.
ii. Nhiệt độ toi ưu, các thông số động hoc enzyme và nhiệt động học phan ứng e Mục dich: xác định và so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phan ứng đến hoạt độ amylase
của hai chê phâm enzyme siêu âm và đôi chứng
_ 33 -
e Cách thực hiện: Mau enzyme siêu âm va enzyme đối chứng được đem đi xác định hoạt độ amylase và các thông số động học (Vmax, Km, Keat, Keat/Km) khi nhiệt độ thay đôi từ 50°C đến 95°C, giá tri pH tối ưu được chọn từ thí nghiệm trước. Gia tri hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện nhiệt độ cho hoạt độ cao nhất.
Các thông số nhiệt động của phan ứng thủy phân tinh bột hòa tan do enzyme xúc
tác sẽ được tính toán dựa vào các giá trị động học theo nhiệt độ phản ứng. Các thông
số nhiệt động gồm có năng lượng hoạt hóa (Ea), enthalpy (AH), entropy (AS), năng
lượng tự do của phản ứng thủy phân tinh bột (AG), năng lượng tự do của giai đoạn
hình thành phức chất giữa enzyme với co chất (AGz.s) và năng lượng tự do của giai đoạn chuyển hóa phức enzyme với cơ chất thành phức enzyme với sản phẩm (AGr.
T).
se Kết qua dự kiến: Xác định được quy luật ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng: giá trị pH và nhiệt độ tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm va enzyme đối chứng: xác định được các thông số
động học và nhiệt động học cua phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan được xúc tác
bởi chế phẩm enzyme siêu âm va enzyme đối chứng.
iii. D6 bên hoạt tính của chế phẩm Termamyl 120L
— Mục đích: xác định và so sánh ảnh hưởng của thời gian (phản ứng hay bảo quản) đến hoạt độ a — amylase trong hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng ở các nhiệt
độ khác nhau.
— Cách thực hiện:
- _ Nhiệt độ phản ứng: Chế phẩm enzyme (không có mặt co chất) được ủ trong một gi0 ở các giá tri nhiệt độ khác nhau gồm 709C, 75°C, 80°C, 85°C, 90°C. Trong thời gian u, tién hanh lay mẫu sau mỗi 10 phút để xác định hoạt độ a — amylase.
- — Nhiệt độ bao quản: Thí nghiệm được thực hiện tương tự như trên với hai giá tri
nhiệt độ khảo sát là 30°C và 5°C. Thời gian khảo sát là 63 ngày, tiễn hành lay mẫu sau mỗi 7 ngày để xác định hoạt độ a — amylase.
- Tw các kết quả thu được, các thông số động học (kin và t12) va các thông số nhiệt động học (bao gồm năng lượng hoạt hóa (Ea-n), enthalpy (AHin), entropy (ASin),
-34-
năng lượng tự do (AGin)) cua quá trình vô hoạt enzyme được xác định theo phương pháp của Eyring va Stearn (1939) [137].
— Kết qua dự kiến: xác định được hăng số tốc độ vô hoạt enzyme, thời gian “bán hủy”
và các thông số nhiệt động học quá trình vô hoạt amylase của mẫu enzyme siêu âm
và enzyme đôi chứng ở các nhiệt độ khác nhau.
24.2.2 Phan 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Dextrozyme GA
a. Anh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm
Dextrozyme GA
Thí nghiệm được thực hiện tương tự phan 2.4.2 (muc 2.4.2.1) voi thong số cần xác định là hoạt độ glucoamylase. Chế phẩm Dextrozyme GA là một tổ hợp của nhiều enzyme glucoamylase nên luận án nay không thực hiện các thí nghiệm xác định phổ UV, phố hồng ngoại và phố cộng hưởng từ hạt nhân.
b. Anh hưởng của sóng siêu âm đến tinh chất của chế phẩm Dextrozyme GA
Các yếu tô xử lý siêu âm đã tìm được ở mục 2.4.2.2.a sẽ được sử dụng để làm tăng hoạt tính xúc tác của chế phẩm Dextrozyme GA. Chế phẩm này được gọi tắt là enzyme siêu âm. Trong các thí nghiệm tiếp theo, tính chất của chế phẩm enzyme siêu âm sẽ được so sánh với chế phẩm “enzyme đối chứng” (không qua siêu âm).
e Mục dich: xác định va so sánh ảnh hưởng của pH va nhiệt độ đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng
e Cỏch thực hiện: Mỗi mẫu thớ nghiệm được đem di xỏc định hoạt độ ứlucoamylase khi giá trị pH thay đổi từ 3,5 đến 5,5, nhiệt độ được 6n định ở 65°C. Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện pH khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phan tram so với điều kiện pH cho hoạt độ cao nhất. Tiếp theo, enzyme siêu âm va enzyme đối chứng được đem di xác định hoạt độ amylase khi nhiệt độ thay đôi từ 55°C đến 75°C, pH được giữ ôn định ở gia tri tối ưu xác định được từ thi nghiệm trước. Gia tri hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện nhiệt độ cho hoạt độ cao nhất.
se Kết qua dự kiến: xác định được quy luật ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng và giá trị pH và nhiệt độ tối
thích của chê phầm enzyme siêu âm và enzyme đôi chứng.
-_35-