1.2 HPV và ung thƣ cổ tử cung
1.2.5 Các phương pháp phát hiện HPV .1 Xét nghiệm mô bệnh học
Sau thời gian tồn tại tiềm ẩn trong cơ thể, HPV sẽ kích hoạt tế bào cổ tử cung sinh sản nhanh dẫn đến các tổn thương dị sản tế bào ở mức độ nhẹ (CIN-1), vừa (CIN-2), nặng (CIN-3) rồi đến ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm mô bệnh học xác định sự có mặt của HPV thông qua sự thay đổi đặc hiệu cho những tế bào nhiễm HPV. Nhược điểm của phương pháp này là chỉ phát hiện được HPV trong trường hợp sự xâm nhiễm của tác nhân đã gây ra những biến đổi tế bào, ở giai đoạn sớm hơn khi chưa có những thay đổi tế bào thì không thể phát hiện bằng phương pháp này[3].
Các xét nghiệm sàng lọc tổn thương và phát hiện bất thường tế bào mô bệnh học có thể áp dụng như sinh thiết cổ tử cung, xét nghiệm Pap smear (xét nghiệm tế bào học theo phương pháp Papnicolaous).
Theo phân loại mới của Hệ thống Bethesda, trên mẫu phết tế bào cổ tử cung, những biến đổi tế bào được chia ra các loại sau đây:
- ASC (Atypical Squamous Cells): Tế bào gai không điển hình, với 2 nhóm:
+ ASC–US (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance): Tế bào gai không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao, đôi khi do HPV. Trong tình huống này, có thể làm xét nghiệm HPV để xác định.
+ ASC–H (Atypical Squamous Cells cannot exclude a High-grade squamous intraepithelial abnormality): Tế bào gai không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao, có thể liên quan với tổn thương tiền ung thư.
- AGC (Atypical Glandular Cells): Tế bào tuyến cổ trong không bình thường, không điển hình, nhưng không thể biết tại sao.
- AIS (endocervical Adenocarcinoma In Situ): Có tế bào tiền ung thư tuyến tại chỗ.
- LSIL (Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion): Tổn thương trong biểu mô độ thấp, tổn thương nhẹ, thường gặp, nhất là ở phụ nữ trẻ, thường được coi là tổn thương do HPV, đa số tự khỏi sau vài tháng đến vài năm.
- HSIL (High-grade Squamous Intraepithelial Lesion): Tổn thương trong biểu mô độ cao. Tổn thương này có tế bào kích thước và hình dạng khác nhiều so với tế bào bình thường, là tổn thương nặng, có thể diễn tiến thành ung thư nếu không được điều trị đúng và kịp thời.
1.2.5.2 Các phương pháp phát hiện HPV ở mức độ phân tử
Do HPV không phát triển trong điều kiện nuôi cấy ở phòng thí nghiệm mà chỉ có thể thực hiện nghiên cứu invivo trên người hay động vật bị nhiễm, các kháng nguyên capsid của virus xuất hiện không ổn định và kháng thể kháng protein capsid HPV vẫn tồn tại nhiều năm sau khi đã loại bỏ hoàn toàn HPV nên các xét nghiệm miễn dich học rất ít được sử dụng trong xét nghiệm HPV[7]. Trạng thái sống tiềm ẩn của HPV khi xâm nhập vào cổ tử cung thường kéo dài từ 1-8 tháng, không phát triển, không gây tổn thương, có hoặc không có các triệu chứng nhẹ, không đặc hiệu.
Do đó các kỹ thuật xét nghiệm tế bào học, giải phẫu bệnh, soi cổ tử cung đều khó có thể phát hiện chính xác sự có mặt của HPV. Chỉ những xét nghiệm sinh học phân tử có độ nhạy cao như PCR, lai phân tử mới có khả năng phát hiện được HPV[3].Các phương pháp phân tử phát hiện HPV có thể chia thành hai nhóm chính: phương pháp dựa vào khuếch đại tín hiệu để phát hiện mục tiêu và phương pháp phát hiện dựa vàoviệc trực tiếp khuếch đại mục tiêu[43].
1.2.5.2.1 Khuếch đại tín hiệu
Phương pháp lai là một trong những phương pháp khuếch đại tín hiệu được sử dụng phổ biến để phát hiện HPV trong bệnh phẩm, dựa trên sự phát quang bằng phản ứng hóa học của phức hợp gồm kháng thể bị bắt giữ dung dịch lai và tín hiệu được khuếch đại. Các phương pháp lai sử dụng trong phát hiện HPV bao gồm[14]:
• Xét nghiệm lai bắt giữ thế hệ 2 (Hybrid Capture 2 HPV Test - Qiagen)
Kỹ thuật lai bắt giữ là kỹ thuật lai được ứng dụng phổ biến nhất để phát hiện HPV. Kit Hybrid Capture 2 HPV Test (HC2) ứng dụng kỹ thuật lai bắt giữ để phát hiện HPV do tập đoàn Diegene công bố và được US FDA công nhận vào năm 1999 là kỹ thuật được sử dụng nhiều hơn trong lâm sàng.
Nguyên tắc kỹ thuật dựa trên hiện tượng lai HPV ADN với probeARN đặc hiệu. Xétnghiệm này mẫu ADN được giải phóng nhờ môi trường kiềm có độ ly giải cao chuẩn bị cho việc lai với hỗn hợp probe là các đoạn ARN đặc hiệu với trình tự của 13 chủng HPV nguy cơ cao (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 và 68) 5 chủng HPV nguy cơ thấp (6, 11, 42, 43 và 44), probeARN có thể được đánh dấu phóng xạ hoặc không đánh dấu phóng xạ. Thể lai giữa ARN – ADN chỉ được tạo ra khi có mặt của HPV ADN.Một kháng thể đơn dòng đặc hiệu cố định các thể lai ARN-ADN vào đĩa.Phức hợp lai ADN-ARN được phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu đã gắn alkaline phosphatase trên máy miễn dịch huỳnh quang. Mỗi phức hợp lai sẽ phát một tín hiệu huỳnh quang (relative light unit - RLU), số lượng tín hiệu huỳnh quang tương ứng lượng ADN đích trong mẫu bệnh phẩm (Hình 1.6)[14, 43].
Xét nghiệm bán định lượng này được sử dụng trong lâm sàng để cảnh báo nguy cơ ung thư cổ tử cung. Xét nghiệm nàycó độ nhạy cao với khả năng phát hiện ADN HPV16 ở nồng độ 1pg/μl, tương ứng với 105 copy, rất dễ thực hiện và dễ dàng đối chiếu giữa các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên xét nghiệm này không cho xác định chủng một cách đặc hiệu, do đó không phải là phương án tối ưu cho các nghiên cứu dịch tễ học đánh giá hiệu quả của vắc xin đặc hiệu cho các chủng HPV[43].
Hình 1.6. Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV[14]
• Phương pháp lai Southern-blot
Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận ADN của màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn ADN được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích thước của chúng và phương pháp chuyển ADN từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của phương pháp lai do E.M Southern mô tả năm 1975.
Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV. Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn ADN đích sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym). Các điều kiện cho quá trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối.
Có nhiều phương pháp đánh dấu mẫu dò oligonucleotid khác nhau được sử dụng nhưng đa số mẫu dò thường đánh dấu ở đầu 5’ bằng 32P hoặc bằng các chất không phải là phóng xạ như chất nhuộm huỳnh quang đã được gắn với horseradish peroxydase, với alkaline phosphatase, với digoxygenin. Sau đó, phức hợp mẫu dò đã đánh dấu sẽ được phát hiện bởi các kháng thể đặc hiệu[5].
Lai Southern-blot có thể sử dụng ADN tách từ bệnh phẩm đã bảo quản hoặc bệnh phẩm tươi. Sự xuất hiện của sản phẩm lai được đánh giá như tiêu chuẩn chẩn đoán sự có mặt của HPV trong bệnh phẩm vì kích thước của kích thước của đoạn lai được đánh giá bằng nội kiểm dương đặc hiệu cho mỗi phản ứng. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét nghiệm chuyên sâu.
1.2.5.2.2 Khuếch đại mục tiêu
Phương pháp khuếch đại mục tiêu được sử dụng phổ biến nhất là PCR.
Nhiều thí nghiệm PCR đặc hiệu chủng đã được phát triển để phát hiện sự có mặt của từng chủng HPV nhưng các nghiên cứu dịch tễ nói chung thường đòi hỏi phải lý giải được sự có mặt của nhiều chủng HPVchủ chốttìm thấy trong đường sinh dục.
Vấn đề này được giải quyết bằng cách khuếch đại một phần bộ gen HPVđươc bảo tồn bền vững như gen L1, xét nghiệm được gọi là PCR phát hiện HPV dựa trên đoạn gen L1. Xét nghiệm PCR phát hiện tất cả các chủng HPV được đưa ralần đầu tiên bởi Manos và cộng sự. Xét nghiệm này dùng cặp mồi MY09/11 khuếch đại đoạn sản phẩm dài 450 bp để phát hiện sự có mặt của HPVvà sau đó xác định chủng được thực hiển bằng các kỹ thuật khác như RFLP, giải trình tự ADNvà RBH với các đầu dò oligonucleotide đặc hiệu các chủng. Các cặp mồi bổ sung nhắm tới cùng một vùng mã hóa trong L1 được sử dụng khá rộng rãi, bao gồm GP5+/GP6+, SPF10khuếch đại đoạn sản phẩm tương ứng dài khoảng 160 bp, 65 bp. Do kích thước sản phẩm nhỏ nên các đoạn mồi GP5+/6+ vàSPF được sử dụng nhiều hơn với các mẫu bảo quản trong parafin để tăng độ nhạy của xét nghiệm với các acid nucleic đứt gãy. Do kích thước rất nhỏ sản phẩm khuếch đại mà phương pháp Elisa lai ADN trên đĩa được thực hiện nhiều cho mồi SPF. Việc phát hiện ra sản phẩm khuếch đại chứng tỏ sự hiện diện của HPV, với thể lai đặc hiệu có thể xác định được từng chủng HPV. Việc định typetừ các sản phẩm khuếch đại đểphát hiện tất cả các chủng HPV được thực hiện phổ biến nhất bằng RBH, trong đó sản phẩm khuếch đại lai với đầu dò đặc hiệu chủng gắn trên màng và sau đó phát hiện bằng phương pháp so màu hoặc quang hóa.Các phương phápkhuếch đại mục tiêu để phát hiện và định chủng HPV sử dụng được phát triển và sử dụng ngày càng nhiều và phong phú hơn. Các phòng thí nghiệm cần phải thẩm định lại độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà họ sử dụng, cho dù đó là xét nghiệm tự xây dựng hay là xét nghiệm mua trên thị trường, nhằm đảm bảo rằng các xét nghiệm này sẽ nâng cao được khả năng chẩn đoán phát hiện HPV[43].
Bảng 1.3.Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV[43]
Tên mồi Gen đích Chiều dài sản phẩm
MY09/MY11 L1 450 bp
GP5+/GP6+ L1 160 bp
SPF10 L1 65 bp
PCR:
Một số kit thương mại phát hiện HPV ADN dựa trên nguyên lý phản ứng
+ Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là kỹ thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV ADN và HPV genotype, dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng primer PGMY09/11 khuếch đại vùng gen L1 HPV. Sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò gồm các mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng. Phức hợp gắn được phát hiện bằng mắt thường. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 27 HPV genotype khác nhau trong đó có 11 type LR-HPV. Hiện nay, trên thương mại đã công bố Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện 37 HPV genotype bao gồm 14 type LR-HPV. Đây là loại kit được sử dụng phổ biến nhất trong các phòng thí nghiệm ở Châu Âu, đã được FDA chấp thuận nhưngchưa được phê chuẩn. Ngoài ra, trên thương mại còn có kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Ghent, Begium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 HPV genotype khác nhau, L1 ADN HPV được khuếch đại bằng primer SPF 10 và được lai với các probeđặc hiệu trên màng. Phương pháp này chỉ tập trung xác định sự có mặt của HPV qua gene L1, trong trường hợp virus đã xâm nhập vào trong tế bào và có sự cắt bỏ 1 số gen không cần thiết thì xác định bằng phương pháp này sẽ là không chính xác.
+ Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là kỹ thuật có thể phát hiện 13 type HPV "nguy cơ cao". Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứngPCR khuếch đại sản phẩm lai sau khi ADN đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang. Nhược điểm của kit là chỉ phát hiện được nhóm genotype HPV mà không phát hiện từng HPV genotype đặc hiệu. So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện được 13 type HPV "nguy cơ cao") cho thấy độ tương đồng là 83,3%[7].
+ Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu. Primer kit gồm 24 mẫu dò tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng. Sau khi sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò sẽ được gắn R-phycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex. Đây là Kit có độ nhạy cao và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kit thường chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao.
1.2.5.2.3 Phương pháp Realtime PCR
Các phương pháp PCR thông thường chỉ đánh giá định tính mà không đánh giá định lượng vi rút. Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng ADN HPV.
Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với realtime PCR người làm thí nghiệm không cần làm tiếp các thí nghiệm để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay không. Phản ứng realtime PCR cho phép phát hiện các bản sao được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt bằng cách sử dụng probe (đoạn dò)có khả năng phát huỳnh quang dưới tác động của nguồn sáng kích thích.Kết quả sản phẩm khuếch đại hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lượng bản sao ADN được tổng hợp.Do đó đây là phương pháp khuếch đại đồng thời cả mục tiêu và tín hiệu để phát hiện tác nhân đích.
Nguyên lý của kỹ thuật realtime PCR sử dụng Taqman probe: Trong phản ứng Realtime PCR ngoài các thành phần giống phản ứng PCR cơ bản còn cần probe (probe) có thể phát huỳnh quang khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu. Probe là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn trình tự trên ADN đích, đầu 5’ có gắn huỳnh quang (reporter) còn đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh qang tương ứng (quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại, probe vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ ở probe hấp phụ do vậy huỳnh quang sẽ không được phát ra dưới tác động của nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại, probe bắt cặp vào sợi khuôncủa sản phẩm sẽ cản trở hoạt động Enzyme Taq polymerase kéo dài primer tổng hợp mạch bổ sung, do đó probe sẽ bị enzyme này thủy phân bởi hoạt tính 5’-3’
exonuclease giải phóng ra đầu reporter của probe, reporter rời xa quencher sẽ phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lượng reporter tự do càng lớn, dưới tác động của nguồn sáng kích thích mà cường độ huỳnh quang reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng[4]. Multiplex realtime PCR nguyên lý cũng tương tự như kỹ thuật realtime PCR nhưng sử dụng nhiều probe trong cùng một phản ứng giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và phát hiện được nhiều tác nhân trong cùng một phản ứng.
Đường chuẩn của phản ứng được xây dựng dựa trên số lượng bản sao ADN đích trong một gam mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngưỡng cho từng mẫu tương ứng. Chu kỳ ngưỡng (Ct-threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Nếu số lượng ADN đích càng lớn thì Ct càng nhỏ và nếu số lượng ADN đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. Phản ứng real-time PCR lý tưởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt, định lượng được sản phẩm ADN và ARN. Phương pháp này có thể phát hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm)[4].
Trên thị trường có các loại Kit khác nhau dựa trên nguyên lý của realtime PCR như Roche LightCycler 2, GenoID realtime HPV Kit hoạt động trên hệ thống Applied Biosystems 7900 HT. Những kit này thường được sử dụng trong chẩn đoán invitro tại Châu Âu, tuy nhiên vẫn chưa được FDA công nhận.
Cobas® kit 4800 Roche định tính HPV trong các mẫu bệnh phậm dựa trên nguyên lý là Realtime PCR, được FDA công nhận, đã được thương mại hóa, sử dụng rộng rãi để phát hiện các gennotype HR-HPV 16, 18, nhóm HPV31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.
Từ những ưu điểm giá thành hợp lý, nhanh và chính xác nêu trên, chúng tôi quyết định chọn Realtime PCR là phương pháp dùng trong nghiên cứu.