CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
3.1 Xây dựng kỹ thuậtRealtime PCR phát hiện các chủng HPV 16,18 và 33/52 Sau khi chọn được các cặp primer và probe, tối ưu được các điều kiện cho kỹ
3.1.1 Kỹ thuậtRealtime PCR đơn cặp primer và probe
Thực hiện kỹ thuậtRealtime PCR đơn cặp primer, probe với các chủng HPV hiện có trong bộ mẫu chuẩn để đánh giá tính đặc hiệu của các cặp primer và probe được thiết kế.
3.1.1.1 Kỹ thuật Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16
Cặp primer và probe phát hiện HPV16 cho tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở kênh HEX. Kết quả của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 phân tích trên kênh HEX được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct
Theo kit thương mại * Theo phương pháp nghiên cứu
1 A248 HPV16 Dương tính/27,3 Dương tính/26,2
2 B522 HPV16 Dương tính/37,9 Dương tính/36,6
3 A147 HPV18 Âm tính Âm tính
4 A352 HPV31 Âm tính Âm tính
5 B206 HPV33 Âm tính Âm tính
6 A218 HPV39 Âm tính Âm tính
7 B455 HPV45 Âm tính Âm tính
8 A504 HPV51 Âm tính Âm tính
9 A468 HPV52 Âm tính Âm tính
10 A531 HPV56 Âm tính Âm tính
11 A448 HPV62 Âm tính Âm tính
12 A243 HPV66 Âm tính Âm tính
13 A319 HPV68 Âm tính Âm tính
14 Chứng âm - Âm tính Âm tính
*Kết quả xác định bằng Kit Cobas 4800 Roche (FDA), PTN MDVX.
A248; B522
Hình 3.1. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16
Chú thích: màu đỏ và vàng tương ứng với mẫu A248 và B522 của genotype HPV16
Phân tích kết quả trên kênh HEX, cho thấy cặp primer và probe phát hiện HPV16 chỉ cho kết quả dương tính với 2 mẫu HPV16 (Bảng 3.1) tương ứng với 2 đường tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.1, giá trị Ct thu được tương đương với kết quả của bộ mẫu chuẩn xác định trước đó với kit của Roche. Với các mẫu HPV chủng khác,kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 đều cho kết quả âm tính. Qua đó ta có thể kết luận rằng cặp primer và probe phát hiện HPV16 là đặc hiệu, phát hiện được chính xác tác nhân đích, tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở đúng kênh HEX, không có sự nhiễu tín hiệu với các kênh đọc khác.
3.1.1.2 Kỹ thuậtrealtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18
Cặp primer phát hiện HPV18 cho tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở kênh Cy5.
Kết quả của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18 phân tích trên kênh Cy5được trình bày ở Bảng 3.2 và Hình 3.2.
Phân tích kết quả trên kênh Cy5, cho thấy cặp primer và probe phát hiện HPV18 chỉ cho kết quả dương tính với 3 mẫu HPV18 (Bảng 3.2) - tương ứng với các đường tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.2 - và kết quả âm tính với các mẫu HPV chủng khác. Qua đó ta có thể kết luận rằng cặp primer và probe phát hiện HPV18 là đặc hiệu, phát hiện được chính xác tác nhân đích, tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở đúng kênh Cy5, không có sự nhiễu tín hiệu với các kênh đọc khác.
Bảng 3.2. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18 STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct
Theo kit thương mại * Theo phương pháp nghiên cứu
1 A149 HPV18 Dương tính/27,8 Dương tính/24,9
2 A264 HPV18 Dương tính/29,5 Dương tính/28,1
3 A549 HPV18 Dương tính/30,0 Dương tính/27,6
4 A248 HPV16 Âm tính Âm tính
5 B522 HPV16 Âm tính Âm tính
6 A468 HPV52 Âm tính Âm tính
7 B557 HPV52 Âm tính Âm tính
8 A352 HPV31 Âm tính Âm tính
9 B206 HPV33 Âm tính Âm tính
10 A424 HPV33,52 Âm tính Âm tính
11 A218 HPV39 Âm tính Âm tính
12 A336 HPV39 Âm tính Âm tính
13 B455 HPV45 Âm tính Âm tính
14 A504 HPV51 Âm tính Âm tính
15 B367 HPV51 Âm tính Âm tính
16 A531 HPV56 Âm tính Âm tính
17 A259 HPV56,62 Âm tính Âm tính
18 A448 HPV62 Âm tính Âm tính
19 A243 HPV66 Âm tính Âm tính
20 B473 HPV66,81 Âm tính Âm tính
21 A319 HPV68 Âm tính Âm tính
22 B511 HPV68 Âm tính Âm tính
23 A556 HPV35,68 Âm tính Âm tính
24 B422 HPV52,58 Âm tính Âm tính
25 B129 HPV51,58 Âm tính Âm tính
26 B344 HPV16,44,74 Âm tính Âm tính
27 A646 HPV81 Âm tính Âm tính
28 A514 HPV51 Âm tính Âm tính
29 Chứng âm - Âm tính Âm tính
* Kết quả xác định bằng Kit Cobas 4800 Roche (FDA), PTN MDVX.
A149; A264; A549
Hình 3.2. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18
Chú thích: màu đỏ, vàng và hồng tương ứng với mẫu A149, A264 và A549 của genotype HPV18
3.1.1.3Kỹ thuật Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 Cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 cho tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở kênh FAM. Kết quả của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 phân tích trên kênh FAM được trình bày ở Bảng 3.3 và Hình 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct
Theo kit thương mại * Theo phương pháp nghiên cứu
1 A468 HPV52 Dương tính/36,5 Dương tính/31,1
2 B557 HPV52 Dương tính/38,5 Dương tính/24,2
3 B206 HPV33 Dương tính Dương tính/21,8
4 A248 HPV16 Âm tính Âm tính
5 A147 HPV18 Âm tính Âm tính
6 A149 HPV18 Âm tính Âm tính
7 A549 HPV18 Âm tính Âm tính
8 A352 HPV31 Âm tính Âm tính
9 A218 HPV39 Âm tính Âm tính
10 B455 HPV45 Âm tính Âm tính
11 A504 HPV51 Âm tính Âm tính
12 B367 HPV51 Âm tính Âm tính
13 A351 HPV56 Âm tính Âm tính
14 A448 HPV56 Âm tính Âm tính
15 A243 HPV66 Âm tính Âm tính
16 A319 HPV68 Âm tính Âm tính
17 Chứng âm - Âm tính Âm tính
* Kết quả xác định bằng Kit Cobas 4800 Roche (FDA), PTN MDVX.
A468; B557; B206
Hình 3.3. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52
Chú thích: màu tương ứng với mẫu A468, B557 (HPV52); màu tương ứng với mẫu B206 (HPV33)
Phân tích kết quả trên kênh FAM, cho thấy cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 chỉ cho kết quả dương tính với các mẫu HPV33 và 52 (Bảng 3.3),tương ứng với đường tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.3 - và cho kết quả âm tính với các chủng HPV còn lại. Qua đó ta có thể kết luận rằng cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 là đặc hiệutác nhân đích, tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở đúng kênh FAM, không có sự nhiễu tín hiệu với các kênh đọc khác.
3.1.1.3 Kỹ thuật Realtime PCR đơn cặp primer và probe chứng nội kiểm (IC) Cặp primer và probe IC nhận biết đoạn trình tự trên gen HMBS – có mặt trong tất cả các mẫu ADN tách chiết thành công, cho tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở kênh Cy5.5. Kết quả của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC phân tích trên kênh Cy5.5 trình bày ở Bảng 3.4 và Hình 3.4.
Phân tích kết quả trên kênh Cy5.5, cho thấy cặp primer và probe IC cho kết quả dương tính với mẫu của tất cả các chủng HPV (trong đó có HPV16, 18, 33, 52) và mẫu âm tính với các chủng HPV (Bảng 3.4), tương ứng với đường tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.4. Qua đó ta có thể kết luận rằng cặp primer và probe IC là nhận biết đặc hiệu đoạn trình tự gen HMBS, quá trình tách chiết ADN thành công, không có mặt chất ức chế trong thành phần phản ứng realtime PCR; tín hiệu huỳnh quang thu nhận ở đúng kênh Cy5.5 do đó không có sự nhiễu tín hiệu với các kênh đọc khác.
Bảng 3.4.Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC STT Tên mẫu Genotype Kết quả/giá trị Ct
(Theo phương pháp nghiên cứu)
1 A305 HPV16 Dương tính /26,8
2 TEB094 HPV16, 18 Dương tính /23,2
3 A147 HPV18 Dương tính /23,1
4 B252 HPV18,52 Dương tính /24,5
5 A424 HPV52, 33 Dương tính /24,4
6 B206 HPV33 Dương tính /25,9
7 A1(*) - Dương tính /23,4
8 A2(*) - Dương tính /24,8
9 A3(*) - Dương tính /28,8
10 Chứng âm - Âm tính
(*) Mẫu âm tính với các chủng HPV
A305; A147; TEB094; B252; B557; A424; B206 Hình 3.4. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn
cặp primer và probe IC
Màu đỏ và vàng tương ứng với mẫu A305 và TEB094 (HPV16)
Màu hồng, vàng, xanh lá tương ứng với mẫu A147, TEB094, B252 (HPV18)
Màu xanh lá, xanh dương, tím, nâu tương ứng với mẫu B252, B557, A422, B206 (HPV52)