CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
3.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện củakỹ thuật Realtime PCR
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1 sau khi tinh sạch được tiến hành đo OD để xác định nồng độ, từ đó tính được số bản copy của plasmid như sau:
Plasmid A149 – HPV18L1 (OD = 189,65ng/ul) chứa 3.8x1010 copy/ul Plasmid B578 – HPV52L1 (OD = 160,42 ng/ul) chứa 3x1010 copy/ul Plasmid A248 – HPV16E6-E7 (OD = 220,75ng/ul) chứa 5.2x1010 copy/ul Chứng dương là hỗn hợp của 3 Plasmid: A248 mang đoạn chèn HPV16E6- E7 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV16 cho tín hiệu ở kênh HEX; A149mang đoạn chèn HPV18L1 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV18 cho tín hiệu ở kênh Cy5; B578 mang đoạn chèn HPV52L1 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV33/52cho tín hiệu ở kênh FAM.
Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật multiplex Realtime PCR ở các nồng độ chứng dương sau 105, 103,102, 101,100 copy/ul. Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 và Hình 3.14.
Bảng 3.6. Kết quảkỹ thuậtRealtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương
STT Nồng độ
chứng dương copy/ ul
Kết quả/giá trị Ct
HPV16HEX Cy5
HPV18 FAM
HPV52 1 10^5 Dương tính /19,9 Dương ính /20,5 Dương tính /18,1 2 10^3 Dương tính /26,3 Dương tính /27,1 Dương tính /24,8 3 10^2 Dương tính /29,8 Dương tính /30,9 Dương tính /28,5 4 10^1 Dương tính /33,3 Dương tính /33,1 Dương tính /31,6
5 10^0 Dương tính /35,8 Dương tính /36,2 Âm tính
Hình 3.14A
HEX
Hình 3.14B
Hình 3.14C
Cy5
Hình 3.14D
Hình 3.14E
FAM
Hình 3.14F
105; 103; 102; 101; 100
Hình 3.14. Kết quả kỹ thuật Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dươngtrên kênh HEX, Cy5 vàFAM
Hình 3.14A, C, E. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên kênh HEX, Cy5 vàFAM Hình 3.14B, D, F. Đường chuẩn của kỹ thuật realtime PCR trên kênh HEX, Cy5 vàFAM Chú thích: màu tương ứng với chứng dương ở các nồng độ 105, 103, 102, 101 và100copy/ ul
Kết quả phân tích trên kênh HEXtrong Bảng 3.6 cho thấy ở tất cả các nồng độ của chứng dương đều cho kết quả dương tính, tương ứng với 5 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trong Hình 3.14A. Giá trị Ct ở các nồng độ từ cao đến thấp có sự tuyến tính, khi giảm nồng độ 10 lần sau mỗi bậc pha loãng thì giá trị Ct giảm xuống trung bình 3.2 Ct, giá trị Ct ở các nồng độ pha loãng đều dao động trên đường chuẩn (Hình 3.14B). Từ kết quả trên kênh HEXxác định được nồng độ thấp nhất của chứng dương HPV16 mà phản ứng Realtime PCR có thể phát hiện được là 10^0copy/ul, tương ứng với thể tích 3ul mẫu trong mỗi phản ứng Realime PCR thì có 3 bản copy của plasmid, hay có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV16 trong kỹ thuật realtime PCR chỉ với 3 bản copy.
Kết quả phân tích trên kênh Cy5 ở Bảng 3.6 và Hình 3.14C, 3.13D cũng tương tự như ở kênh HEX. Rút ra kết luận là có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV18 trong kỹ thuật realtime PCR chỉ với 3 bản copy.
Kết quả phân tích trên kênh FAMởBảng 3.6 chỉ ra rằng tất cả các nồng độ của chứng dương đều cho kết quả dương tính, trừ nồng độ 100 copy/ul thể hiện qua 4 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.14E. Giá trị Ct ở các nồng độ từ cao đến thấp có sự tuyến tính, khi giảm nồng độ 10 lần sau mỗi bậc pha loãng thì giá trị Ct giảm xuống trung bình 3.2 Ct, các giá trị Ct tương ứng với từng bậc pha loãng cũng giao động quanh đường chuẩn (Hình 3.14F). Từ kết quả trên kênh FAM xác định được nồng độ thấp nhất của chứng dương HPV33/52 mà phản ứng Realtime PCR có thể phát hiện được là 10^1 copy/ul, tương ứng với thể tích 3ul mẫu trong mỗi phản ứng Realime PCR thì có 30 bản copy của plasmid, hay có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV33/52 trong phản ứng Realtime PCR chỉ với 30 bản.
Từ đây chúng tôi đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR như sau: kỹ thuật realtime PCR phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV16, HPV18, HPV33/52 với số bản copy trong mỗi phản ứng tương ứng như sau: 3, 3, 30/30 copy/phản ứng và khả năng phát hiệncủa phương pháp với tác nhân HPV16 và HPV 18 tuyến tính trong khoảng 3x100đến 3x105 copy/phản ứng, với tác nhân HPV33/52 tuyến tính trong khoảng 3x101 đến 3x105 copy/phản ứng.