CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Chứng dương của kỹ thuật realtime PCR là hỗn hợp của 3 plasmid mang các đoạn chèn của trình tự đích do đó luôn được nhận biết khi có mặt trong phản ứng realtime PCR. Sản xuất chứng dương bằng cách tạo ra các plasmid mang đoạn chèn là trình tự đích. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 được xác định bằng số bản copi tối thiểucủa chứng dươngtrong một phản ứng mà kỹ thuật realtime PCR vẫn phát hiện được.
2.2.2.1 Khuếch đại trình tự
gen đích của phản ứngRealtimePCR
Trình tự gen đích gồm HPV16E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1. Do cặp primervà probe phát hiện HPV33/52 phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu giống nhau trên cả 2 chủng HPV33 và 52 nên sử dụng trình tự HPV52L1 để tạo chứng dương cho tác nhân HPV33/52.
• Thiết kế primer khuếch đại các trình tự đích
Trình tự primer dùng để khuếch đại gen E6-E7 của chủng HPV 16 được tham khảo từbài báo[24] trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI). Trình tự gen L1 của các chủng HPV18, HPV52 ngoài việc sử dụng cho nghiên cứu chính này còn được sử dụng cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn, nên nhóm nghiên cứu tham khảo các trình tự gen L1 của các chủng HPV18, 52 trên cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI) và tự thiết kế cặp primer khuếch đại gen L1 của các chủng HPV18 và HPV52. Sử dụng các phần mềm tin sinh Mega5, Primer5 đánh giá lại cặp primer được lựa chọn.
Thiết kế được 3 cặp primer để khuếch đại trình tự đích của phản ứng Realtime PCR HPV16 E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1cho các đoạn sản phẩm có kích thước tương ứnglà 876bp, 1720bp và 1606bp.
• Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích
Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự gen E6-E7 của HPV16 và L1của HPV18, 52. Tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng cặp primer: nồng độ primer, dNTP, MgCl2, nồng độ và loại enzyme (Dream Taq, green 2X Master mix, Fedili Taq), nhiệt độ gắn primer. Các thành phần, nồng độ tương ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR đươc trình bày ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4.Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích
STT Thành phần 25àl/1pư Nồng độ cuối cựng
1 H2O-DEPC 14.4 àl -
2 Dream Taq Buffer 10X 2.5 àl 1X
3 Primer forward (10 àM) 0.5 àl 200nM
4 Primer reverse (10 àM) 0.5 àl 200nM
5 dNTP (10mM) 1.0 àl 0.4mM
6 MgCl2 (25mM) 1.0 àl 1mM
7 Enzyme Dream Taq 0.1 àl 20U/ml
8 AND HPV 5 àl -
9 Tổng 20 àl -
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích Trình tự HPV16E7E6-E7 HPV18L1 HPV52L1
94ºC – 3p
40 chu kỳ
94ºC – 30s 48ºC – 30s 72ºC – 1p
94ºC – 30s 42ºC – 30s 72ºC – 2p
94ºC – 30s 50ºC – 30s 72ºC – 2p 72ºC– 10p
4ºC – ∞
• Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di cho kết quả dương tính với các băng có kích thước mong muốnđược tinh sạch bằng Kit tinh sạch ADN Promega.
Đo OD sản phẩm sau tinh sạch và tiến hành phaloãng để mẫu đạt nồng độ 50 ng/ul và gửi đi giải trình tự ở công ty Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit và Mega5 để chọn lọc ra các trình tự tiêu biểu để tiến hành nhân dòng.
2.2.2.2 Sản xuất chứng dươngvà xác định giới hạn phát hiện củakỹ thuật realtime PCR
• Nhân dòng trình tự đích tạo chứng dương
Sản phẩm PCR HPV16E6-E7, HPV18L1, HPV52L1 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chọn lọc tiến hành chèn gen vào trong vector Pentr D.Topo (với HPV18L1 và HPV52L1) và vector pGEM T easy (với HPV16E6-E7), biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, rồi tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng.
Kiểm tra kết quả nhân dòng gen bằng phản ứng PCR các khuẩn lạc nuôi cấy với cặp primer của vector pGEM-T hoặc cặp primer khuếch đại đoạn chèn (trình tự đích). Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn để PCR sang đĩa nuôi cấy khác.
Nuôi khuẩn lạc mang đoạn chèn của HPV trong falcol 15ml chứa môi trường LB lỏng có bổ sung Kanamycine 50mg/ml trong 16-18h. Sau đó tinh sạch plasmidtừ dịch nuôi cấy bằng kit tinh sạch Plasmid của Promega. Plasmid sau tinh sạch được điện di kiểm tra và kiểm tra lại bằng phản ứng PCR với cặp primer vector.
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1 sau tinh sạch được sử dụng để tạochứng dương của phản ứng Realtime PCR.
• Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1sau khi tinh sạch được tiến hành đo OD để xác định nồng độ, từ đó tính được số bản copy của plasmid theo công thức sau [44]:
A = (X*6.0221*1023) / (N*660*109) Trong đó A: số bản copy của plasmid trong 1 đơn vị thể tích
X: khối lượng của plasmid trong đơn vị thể tích cần tính
N: chiều dài của plasmid mang đoạn chèn
Tiến hành pha loãng plasmid để tạo chứng dương là hỗn hợp 3 plasmid với dải nồng độ từ 1010 copy/ul đến 100 copy/ul. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng multiplex Realtime PCR ở các nồng độ chứng dương sau 105, 103,102, 101,100 copy/ul. Từ đó xác định được số bản copy tối thiểu của chứng dương trong mỗi phản ứng mà kỹ thuậtmultiplex realtime PCR phát hiện được.
Tối ưu hóa kỹ thuật realtime PCR phát hiện đa tác nhân trên chứng dương vừa sản xuất và dùng kỹ thuật realtime PCR đã được tối ưu hóa để đánh giá các chỉ tiêu của việc thẩm định phương pháp Realtime PCR.