CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
3.3 Thẩm định phương pháp phát hiện một số chủng HPV nguy cơ cao
3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số lặp lại và hệ số tái lập) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phương pháp
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 2 mẫu dương tính với một trong các chủng HPV16, HPV18, HPV33/52, mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn
của nghiên cứu trong đó có 1 mẫu dương tính với HPV16 (TEB101) và 1 mẫu dương tính HPV18, 52 (B252), mỗi mẫu được lặp lại 3 lần trong 1 thí nghiệm. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.8 và Hình 3.16.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị Ct trong 3 lần lặp lại thí nghiệm của từng mẫu được thể hiện ở Bảng 3.9 và Hình 3.17.
Bảng 3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp STT Tên mẫu Genotype Kết quả /giá trị Ct
HEX
HPV16 Cy5
HPV18 Green
HPV33/52 Cy5.5 IC 1 TEB101 (1) HPV16 Dương tính/20,2 Âm tính Âm tính Dương tính/20,9 2 B252 (1) HPV18,52 Âm tính Dương tính
/36,4 Dương tính
/23,4 Dương tính /24,5 3 TEB101 (2) HPV16 Dương tính/21,9 Âm tính Âm tính Dương tính/21,6 4 B252 (2) HPV18,52 Âm tính Dương tính
/32,8 Dương tính
/23,0 Dương tính /24,1 5 TEB101 (3) HPV16 Dương tính/22,2 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,5 6 B252 (3) HPV18,52 Âm tính Dương tính
/33,1 Dương
tính/23,4 Dương tính /24,6
7 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
(1),(2),(3)Lầnlặp lại thứ 1, 2 ,3 trong 1 thử nghiệm
Hình 3.16A.HEX Hình 3.16B.Cy5
Hình 3.16C.FAM Hình 3.16D.Cy5.5
TEB101(1); TEB101(2) ; TEB101(3) B252(1); B252(2); B252(3) Hình 3.16.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp
lại (Hình 3.16A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAMvà Cy5.5) Chú thích:
Màu xanh đậm, nâu, xanh nhạt tương ứng với lần thực hiện thứ 1, 2, 3 với mẫu TEB101 (HPV16)
Màu xanh lá nhạt, xanh lá đậm, xanh dương tương ứng với lần thực hiện thứ 1, 2, 3 với mẫu B252 (HPV18, 52)
Bảng 3.9.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại
Tên mẫu/ kênh đọc Mean 1SD 2SD
TEB101(HPV16)/HEX 21,4 1,1 2,2
B252(HPV18)/Cy5 34,1 2 4
B252(HPV52)/FAM 23,3 0,2 0,4
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.17A
Hình 3.17B
Hình 3.17C
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.17 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại (Hình 3.17 A, B, C tương ứng với các kênh HEX, Cy5 vàFAM)
Trong cả 3 lần lặp lại trong 1 thí nghiệm, mẫu dương tính với HPV16 đều cho kết quả dương tính với kênh HEX (Bảng 3.8), với giá trị Ct không chênh lệch nhau nhiều, thể hiện trên Hình 3.16A cả 3 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang
sau từng chu kì sát nhau và gần như là chồng khít lên nhau. Mẫu dương tính với HPV18 kết quả dương tính với kênh Cy5, giá trị Ct có sự chênh lệch nhau, thể hiện trên Hình 3.16B có một đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang lệch xa 2 đường còn lại. Mẫu dương tính với HPV52 đều cho kết quả dương tính trên kênh FAM, với giá trị Ct không chênh lệch nhau nhiều, thể hiện trên Hình 3.16C cả 3 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang sau từng chu kì sát nhau và gần như là chồng khít lên nhau.
Giá trị Ct giữa 3 lần thực hiện của cùng một mẫu trên các kênh đọc tương ứng HEX, Cy5, FAM đều nằm trong khoảng Mean±2SD (thể hiện trong Bảng 3.9 và Hình 3.17A, B, C), sự biến động Ct giữa các lần thực hiện của cùng một kỹ thuật viên với phương pháp này nằm trong khoảng cho phép. Trên kênh Cy5.5, giá trị Ct thống nhất giữa cả 3 lần chạy, đường tín hiệu huỳnh quang cả 3 lần chạy của 1 mẫu đều chồng khít lên nhau.
3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phương pháp
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 2 mẫu dương tính với một trong các chủng HPV16, HPV18, HPV33/52, mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu trong đó có 1 mẫu dương tính với HPV16 (A410) và 1 mẫu dương tính HPV18, 52 (B252), mỗi mẫu được thực hiện 3 lần bởi 3 kỹ thuật viên khác nhau trong 3 lần thí nghiệm riêng biệt. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.10 và Hình 3.18, 3.19,3.20.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị Ct trong 3 lần thí nghiệm riêng biệt của từng mẫu được thể hiện ở Bảng 3.11 và Hình 3.21.
Kết quả tổng kết trong Bảng 3.10 cho thấy trong cả 3 lần thí nghiệm riêng biệt mẫu A410 (HPV16) đều cho kết quả dương tính trên kênh HEX tương ứng với 1 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình trongHình 3.18A, 3.19A, 3.20A.
Mẫu B252 (HPV18, 52) cho kết quả dương tính trên cả 2 kênh Cy5 (Hình 3.18B, 3.19B, 3.20B) và FAM (Hình 3.18C, 3.19C, 3.20C).Xác định giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (Bảng 3.11), Ct của cùng một mẫu thực hiện bởi 3 kỹ thuật viên khác nhau đều nằm trong khoảng mean ±2SD (Hình 3.21A, B, C), sự biến động Ct giữa các kỹ thuật viên khác nhau với phương pháp này nằm trong khoảng cho phép.Tất cả các mẫu trong cả 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5, chứng âm trong 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ không xảy ra sai sót nhiễm chéo và không có lẫn chất ức chế trong mẫu .
Bảng 3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp Bảng 3.10A.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 1 STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX
HPV16 Cy5
HPV18 FAM
HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính/27,2 Âm tính Âm tính Dương tính
/26,9 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính
/36,4
Dương tính /23,4
Dương tính /24,5
3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10B. Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 2
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX
HPV16
Cy5 HPV18
FAM HPV33/52
Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính/29,9 Âm tính Âm tính Dương tính
/28,1 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính
/34,0
Dương tính /23,9
Dương tính /25,8
3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10C.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 3
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX
HPV16
Cy5 HPV18
FAM HPV33/52
Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính/29.7 Âm tính Âm tính Dương tính
/28.4 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính
/34.0
Dương tính /24.0
Dương tính /25.7
3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Hình 3.18A. HEX Hình 3.18B. Cy5
Hình 3.18C. FAM Hình 3.18D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 1(Hình 3.18A, B, C, D tương ứng vớikênh HEX, Cy5, FAMvà Crimson)
Hình 3.19A.HEX Hình 3.19B.Cy5
Hình 3.19C.FAM Hình 3.19D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 2 (Hình 3.19A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5)
Hình 3.20A.HEX Hình 3.20B.Cy5
Hình 3.20C.FAM Hình 3.20D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252(HPV18, 52)
Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 3(Hình 3.20A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5)
Bảng 3.11. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập Tên mẫu/ kênh đọc Mean 1SD 2SD
A410(HPV16)/HEX 28,9 1,5 3
B252(HPV18)/Cy5 34,8 1,4 2,8
B252(HPV52)/FAM 23,8 0,3 0,6
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.21A
Hình 3.21B
Hình 3.21C
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập (Hình 3.21 A, B, C tương ứng vớikênh HEX, Cy5 vàFAM)
Từ kết quả trên chúng tôi đưa ra kết luận: kỹ thuậtRealtime PCR xác định các chủng HPV16, 18 và 33/52 cho kết quả thống nhất giữa các lần thí nghiệm khác nhau do cùng 1 kỹ thuật viên thực hiện và do 3 kỹ thuật viên khác nhau .
3.3.3 Xác định độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16,