CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu
3.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương
Sản phẩm PCR HPV16E6-E7, HPV18L1, HPV52L1 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chọn lọc tiến hành chèn gen vào trong vector Pentry D.Topo (với
HPV18L1 và HPV52L1) và vector pGEM T easy (với HPV16E6-E7), biến nạp vào tế bào khả biến E. Coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng.
Kiểm tra kết quả nhân dòng gen bằng phản ứng PCR các khuẩn lạc nuôi cấy với cặp primer của vector (cung cấp kèm theo kit). Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn để PCR sang đĩa nuôi cấy khác. Kết quả thu được như sau:
3.2.2.1 Kết quả nhân dòng gen trình tự HPV16E6-E7
Sản phẩm PCR HPV16E6-E7 mẫu A248 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chèn gen vào trong vector pGEM T easy, biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng. Chọn được 15khuẩn lạc đặc trưng, kiểm tra khuẩn lạc với cặp primer của vector T7 SP6 forward và T7 SP6 reverse (cung cấp kèm theo kit), cặp primer này khuếch đại đoạn chứa một phần trình tự của vector và cả đoạn chèn, sản phẩm của cặp primer này dài khoảng 1.1Kb. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%, kết quả trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV16E6-E7
(Giếng 1-16: 15 khuẩn lạc được chọn; Giếng 10: chứng âm; M: thang chuẩn 0.1-2Kb) Quan sát hình ảnh điện di cho thấy trừ chứng âm ở giếng 10 các giếng còn lại đều cho băng kích 1.1Kb, đúng với kích thước mong muốn. 15 khuẩn lạc được lựa chọn đều có plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7. Chọn 3 khuẩn lạc có băng sỏng rừ, tiếp tục nuụi cấy và tinh sạch thu plasmid. Plasmid sau tinh sạch được kiểm tra lại bằng cặp primer của vector và điện di trên agarose 1%, kết quả được thể hiện ở Hình 3.9.
Vector pGEM T easy có kich thước 3015bp khi mang đoạn chèn 876bp có kích thước 3891bp. Điện di plasmid sau tinh sạch cho kết quả dương tính với băng
kích thước khoảng 4000bp (giếng 1, 2, 3 Hình 3.9) và kiểm tra lại plasmid với cặp primer của vector cũng cho băng dương tính với 1100bp (giếng 4, 5, 6 Hình 3.9), chứng tỏ 3 plasmid mẫu A248 sau tinh sạch đều mang đoạn chèn HPV16E6-E7 đủ điều kiện để làm chứng dương cho kỹ thuật realtime PCR.
Hình 3.9. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7
(Giếng 1-3: Plasmid; Giếng 4-6: kiểm tra plasmid cặp primer vector,M: thang chuẩn ADN 1Kb)
3.2.2.2 Kết quả nhân dòng gen trình tự HPV18L1
Sản phẩm PCR HPV18L1 mẫu A149 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chèn gen vào trong vectorPentry D.Topo biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng. Chọn được 15khuẩn lạc đặc trưng, kiểm tra khuẩn lạc với cặp primerkhuếch đại trình tự HPV18L1 dài khoảng 1.7Kb. Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn để PCR sang đĩa nuôi cấy khác. Kết quả được trình bày ở Hình 3.10.
Hình 3.10A Hình 3.10B
Hình 3.10.Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV18L1
Hình 3.10A. Đĩa cấy vạch khuẩn lạc mẫu A149 mang đoạn chèn HPV18L1 Hình 3.10B. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV18L1
(Giếng 1-15: 15 khuẩn lạc được chọn; Giếng 16: chứng âm; M: thangchuẩn 0.1-2Kb)
Quan sát hình ảnh điện di cho thấy trừ giếng 9, 13, 15, 16 các giếng còn lại đều cho băng kích thước 1.7 kb, đúng với kích thước trình tự HPV18L1. Trong 15 khuẩn lạc được lựa chọn ngoài 3 khuẩn lạc tương ứng các giếng 9, 13, 15, các khuẩn lạc còn lại đều có các plasmid mang đoạn chèn HPV18L1. Chọn 6 khuẩn lạc tương ứng với các giếng cho kết quả dương tính, tiếp tục nuôi cấy và tinh sạch thu plasmid. Plasmid sau tinh sạch được kiểm tra lại bằng cặp primer của vector M13 forward và M13 reverse, khuếch đại đoạn dài khoảng 2Kb chứa đoạn chèn và một phần trình tự của vector, điện di trên agarose 1% , kết quả được thể hiện ở Hình 3.11
Hình 3.11. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1
(Giếng 1-6: kiểm tra plasmid với cặp primer vector; Giếng 7: chứng âm; Giếng 8- 13: plasmid; M: thang chuẩn ADN 0.1-2Kb)
Vector Dtopo Pentry có kích thước 2580bp khi mang đoạn chèn 1702bp có kích thước 4282bp. Điện di plasmid sau tinh sạch cho kết quả dương tính với băng kích thước >2Kb (giếng 8-13 Hình 3.11) và kiểm tra lại plasmid với cặp primer của vector cũng cho băng với kích thước khoảng 2Kb (giếng 1-6 Hình 3.11), chứng tỏ 6 mẫu plasmid sau tinh sạch đều mang đoạn chèn đủ điều kiện để làm chứng dương cho kỹ thuật realtime PCR.
3.2.2.3 Kết quả nhân dòng gen trình tự HPV52L1
Sản phẩm PCR HPV52L1 mẫu B578 sau khi tinh sạch và giải trình tự sẽ được chèn vào trong vectorPentry D.Topo biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP10, sau đó nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Kanamycine 50mg/l, tiến hành chọn khuẩn lạc sau 18 tiếng. Chọn được 10 khuẩn lạc đặc trưng kiểm tra khuẩn lạc với cặp primerkhuếch đại trình tự HPV52L1 (kích thước khoảng 1.6Kb), kết quả được trình bày ở Hình 3.12. Đồng thời cấy vạch các khuẩn lạc được chọn sang đĩa nuôi cấy khác.
Quan sát hình ảnh điện di ở Hình 3.12 cho thấy trừ giếng 7, các giếng còn lại
đều cho băng kích thước 1.6 kb, đúng với kích thước trình tự HPV52L1. Trong 15 khuẩn lạc được lựa chọn, ngoài các khuẩn lạc tương ứng với giếng 7, các khuẩn lạc còn lại đều chứa plasmid mang đoạn chèn HPV52L1. Chọn 6 khuẩn lạc tương ứng với các giếng cho kết quả dương tính, tiếp tục nuôi cấy và tinh sạch thu plasmid.
Plasmid sau tinh sạch được kiểm tra lại bằng cặp primer của vector (M13 forward và M13 reverse), khuếch đại đoạn dài khoảng 2Kb chứa đoạn chèn và một phần trình tự của vector, điện di trên agarose 1%, kết quả được trình bày ở Hình 3.13.
Hình 3.12-A Hình 3.12-B
Hình 3.12. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV52L1 Hình 3.12-A. Đĩa cấy vạch khuẩn lạc mẫu B578 mang đoạn chèn HPV52L1 Hình 3.12-B. Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV52L1 (Giếng 1-10: 10 khuẩn lạc được chọn; Giếng 11: chứng âm; M: thang chuẩn 0.1-2Kb)
Hình 3.13A Hình 3.13B
Hình 3.13. Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 Hình 3.13A. Giếng 1-6: plasmid, M: thang chuẩn 1kb Hình 3.13B. Giếng 1-6:kiểm tra plasmid với cặp primer M13
(Giếng 7: chứng âm, M: Thang chuẩn 0.1-2Kb)
Vector Dtopo Pentry có kích thước 2580bp khi mang đoạn chèn 1606bp có kích thước 4186bp. Điện di plasmid sau tinh sạch cho kết quả dương tính với băng
kích thước >4Kb (giếng 1-6 Hình 3.13A), kiểm tra lại plasmid với cặp primer của vector cũng cho băng với kích thước khoảng 2Kb (giếng 1-6 Hình 3.13B), chứng tỏ 6 mẫu plasmid sau tinh sạch đều mang đoạn chèn đủ điều kiện để làm chứng dương cho kỹ thuật realtime PCR.
Sau khi tiến hành nhân dòng thu được 3 plasmid mang đoạn chèn A248- HPV16E6-E7; 6 plasmid mang đoạn chèn A149-HPV18L1; 6 plasmid mang đoạn chèn B578-HPV52L1. Các plasmid này có thể sử dụng làm chứng dương cho phản ứng Realtime PCR và dùng để xác định độ nhạy cho phương pháp.