CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.4. Xác địnhđặc tính những dòng vi khuẩn nội sinh
+ Nguyên tắc
Dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982), hàm lượng đạm NH4
+ được đo bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter ở bước sóng 636 nm để đánh giá khả năng tổng hợp đạm của các chủng vi khuẩn theo nguyên tắc:
Trong phương pháp Indophenol, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, sau đó phản ứng với ammonium tạo thành Indophenol có màu xanh. Sự hiện diệncủa nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng lên khoảng 10 lần. Phản ứng được minh họa qua phương trình sau:
NH4
+ + Phenol Hypochloride ion (môi trường kiềm)
Indophenol (có màu xanh) + Chuẩn bị mẫu
Chủng 1 ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 1 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng đạm tổng hợp.
+ Phương pháp đo đạm (NH4 +) Xây dựng đường chuẩn NH4
+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1- 2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 4. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 1, 2, 3, 4, 5àg/ml NH4
+ (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 4: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4 +
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dich NH4+ chuẩn (1 àg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch Sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
2 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu
0,5 ml dung dịch EDTA
1 ml dung dịch Phenol - Sodium nitroprusside 2 ml dung dịch Sodium hypochloride
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng NH4
+ bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 636 nm (OD636nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có NH4+ , không có màu xanh) làm mẫu đối chứng âm, blank đưa giá trị OD về 0 và tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn. Màu xanh đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn NH4
+. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đú X là nồng độ của mẫu (àg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD636nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD636 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+
tương đương lượng NH4+
có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
3.3.4.2. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan + Nguyên tắc
Để đánh giá lượng lân được hòa tan bởi vi khuẩn nội sinh, ta sử dụng thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolypdate Potassium antinomol tartrate theo nguyên lý:
Chất lân hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với Amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất Phosphomolypdate có màu vàng.
H2PO4
- + NH4
+ + MoO4
2+ + 2H+ → (NH4)3[P(MoO10)4]
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỷ lệ thuận với hàm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg.
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 1ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng có bổ sung apatit, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút.
Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 2 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày để xác định hàm lượng lân hòa tan.
+ Phương pháp đo lân (P2O5)
Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2- 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 5. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 àg/ml P_P2O5 (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dich P_P2O5 chuẩn (10 àg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4
Nước khử khoáng (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Tổng thể tích (ml) 12,5
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
5 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu 4 ml dung dịch B 3 ml nước khử khoáng
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng P_P2O5 bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đú X là nồng độ của mẫu (àg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD880nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân tương đương lượng P_P2O5 có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
Chú ý: Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu (2, 5, 10, 20, 50 lần) để hàm lượng lân đo được có giá trị chính xác.
3.3.4.3. Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) + Chuẩn bị mẫu
Chủng 350 àl dịch huyền phự vi khuẩn đó được nuụi trong mụi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào tuýp eppendorf 2 ml cú chứa 550 àl mụi trường RMR lỏng cú bổ sung tryptophan (100 àg/ml) và khụng bổ sung tryptophan, ủ trong tối. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy tuýp eppendorf chứa mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA tổng hợp.
+ Phương pháp đo IAA
Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2- 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 6. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 àg/ml IAA.
Bảng 6: Thành phần của dãy đường chuẩn IAA
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch thuốc thử Salkowsky (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dich IAA chuẩn (àg/ml) (àl) 0 20 40 60 80 100
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng, trong tối khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn.
Mẫu: các tuýp eppendorf được lấy ra, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
0,5 ml dịch mẫu
1 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530nm).
Chú ý: Thí nghiệm được thực hiện trong tối.
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đú X là nồng độ của mẫu (àg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD530nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD530 nm của mẫu để tính hàm lượng IAA tương đương lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.