3.2.1. Dụng cụ, thiết bị
Sử dụng trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu của phòng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Dụng cụ: cối và chày, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, tuýp eppendorf, đầu cone xanh, đầu conevàng, micropipets, cốc thủy tinh, bình tam giác các loại, ống falcon,…
Thiết bị: tủ cấy, máy đo quang phổ, máy ly tâm, máy lắc, cân điện tử, máy Vortex, máy đo pH, máy khuấy từ, tủ sấy, tủ lạnh, tủ ủ, nồi khử trùng nhiệt ướt, máy ảnh,…
3.2.2. Nguyên vật liệu
Mẫu rễ và thân lúa được thu từ ruộng lúa ở 3 xã thuộc huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên.
3.2.3. Hóa chất
+ Hóa chất dùng để khử trùng mẫu rễ, thân của cây lúa
- Ethanol 96%
- Hydrogen peroxide (H2O2) 3% - Nước cất vô trùng
+ Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh
Bảng 1: Thành phần môi trƣờng RMR (Elbeltagy et al., 2001)
Hóa chất Nồng độ Dung dịch A K2HPO4 0,8 g/l KH2PO4 0,2 g/l NaCl 0,1 g/l Na2FeEDTA 28 mg/l Na2MoO4.2H2O 25 mg/l Yeast extract 100 mg/l Mannitol 3 g/l Sucrose 5 g/l Sodium lactate 60% 0,5 ml/l Malic acid 2 g/l
Agar 18 g/l cho môi trường đặc
hoặc 1,8 g/l cho môi trường bán đặc
Nước cất 900 ml/l pH 7,0 Dung dịch B MgSO4.7H2O 0,2 g/l CaCl2.2H2O 0,06 g/l Nước cất 100 ml/l
Chú ý: Dung dịch A và dung dịch B được khử trùng riêng. Sau khi khử trùng, chúng được trộn lại với nhau và bổ sung thêm 5 µg/l biotin; 1,25 ml dịch trích chồi lúa với ethanol và 1,25 ml dịch trích chồi lúa với nước cất được khử trùng qua màng lọc.
+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn Bảng 2: Thành phần môi trƣờng Burk không đạm (Park et al., 2005)
Hóa chất Nồng độ (g/l) Glucose 10 KH2PO4 0,41 K2HPO4 0,52 Na2SO4 0,05 CaCl2 0,2 MgSO4.7H2O 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 Na2MoO4.2H2O 0,0025
Agar 15 g/l cho môi trường đặc
hoặc 1,8 g/l cho môi trườngbán đặc
pH 7,0
- Dung dịch EDTA (Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt - C16H14N2O8Na2.2H2O): hòa tan 6 gram EDTA trong 100ml nước khử khoáng. - Dung dịch Phenol (C5H5OH)-Sodium nitroprusside dihydrate
(Na2[Fe(CN)5NO].2H2O): hòa tan 7 gram phenol + 0,034 gram sodium nitroprusside trong 100ml nước khử khoáng.
- Dung dịch Sodium hypochloride(NaOCl): hòa tan 1,48 gram NaOH + 4,98 gram Na2HPO4+ 20ml NaOCl (5% - 5,25%) trong nước khử khoáng cho đủ thể tích 100ml.
- Dung dịch đạm chuẩn NH4+
+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng hòa tan lân khó tan của vi khuẩn Bảng 3: Thành phần môi trƣờng NBRIP lỏng (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Nồng độ (g/l) Sucrose 10 MgCl2.6H2O 5 MgSO4.7H2O 0,25 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1 Apatide 5 pH 7,0
- Thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolybdate Potassium antinomol tartrate Dung dịch A:
(1) Hòa tan 12 gram hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate - (NH4)6Mo7O24.4H2O vào 250 ml nước khử khoáng;
(2) Hòa tan 0,2908 gram antimony potassium tartrate - K2[Sb2(C4H4O6)2].3H2O trong 100 ml nước khử khoáng;
(3) Cho từ từ 140 ml Acid sulfuric - H2SO4 đậm đặc vào 1lít nước khử khoáng; (4) Trộn (1), (2) và (3), sau đó thêm nước khử khoáng vào cho đủ 2 lít.
Dung dịch B:
Hòa tan 1,056 gram acid ascorbic trong 200 ml dung dịch A.
Chú ý: Dung dịch B chỉ sử dụng trong ngày, không được để quá 24 giờ. - Dung dịch lân chuẩn P_P2O510 µg/ml.
+ Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) của vi khuẩn
- Thuốc thử Salkowsky
Thêm từ từ 553 ml H2SO4 vào nước cất cho đủ 1 lít, để nguội được dung dịch
H2SO4 đậm đặc 10,8M.
Cân 4,5 gram Iron (III) chloride hexahydrate - FeCl3. 6H2O và thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M vào rồi khuấy cho FeCl3 tan đều.
- Dung dịch IAA chuẩn 1 µg/ml.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn
+ Thu mẫu
Địa điểm thu mẫu: Thu mẫu lúa ở vùng trồng lúa tại 3 địa điểm của huyện Sơn Hòa, tỉnh Phú Yên.
Cách thu mẫu: Thu 3 mẫu lúa ở mỗi địa điểm, mỗi mẫu chọn 4-5 cây lúa đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh.
Cách bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển: Rửa cây lúa dưới vòi nước chảy mạnh cho thật sạch đất bám ở thân và rễ, bảo quản ở 4ºC.
+ Xử lý mẫu
Cắt rời thân và rễ ra thành từng đoạn nhỏ 1-2 cm.
Cho mẫu vào ống falcon và khử trùng bề mặt mẫu lần lượt bằng cồn 96% trong 3 phút và H2O2 3% trong 3 phút, sau đó, rửa lạivới nước cất vô trùng 4 lần để loại các hóa chất còn thừa.
Để kiểm tra vi sinh vật còn sót lại trên bề mặt thân, rễ cây lúa sau khi khử trùng, lấy 200 µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần cuối (lần 4) chủng trên các đĩa chứa môi trường Tryptone -Yeast extract - glucose agar và ủ ở 30ºC trong 24 giờ. Nếu sau 24 giờ, các đĩa môi trường này không xuất hiện các khuẩn lạc thì các mẫu thân (rễ) đã khử trùng đạt yêu cầu.
Mẫu thân và rễ sau khi đã khử trùng cho vào cối vô trùng với 1 ml nước cất vô trùng, giã nhuyễn và hút dịch trích mẫu cho vào tube 1,5 ml vô trùng, trộn đều bằng máy vortex.
+ Chủng dịch trích mẫu thân (rễ) lúa vào môi trường RMR bán đặc
Hút 100 µl dịch trích mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường RMR bán đặc đã khử trùng nhiệt ướt ở 121ºC trong 20 phút (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần), sau đó ủ mẫu ở 30ºC trong 2-3 ngày.
+ Cấy chuyển vi khuẩn từ môi trường RMR bán đặc sang môi trường RMR đặc Sau 2-3 ngày, quan sát thấy các ống nghiệm chứa môi trường RMR bán đặc xuất hiện một lớp màng mỏng (vòng pellicle) cách bề mặt môi trường khoảng 0,5 -1
cm, đó là dấu hiệu chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. Sử dụng que cấy đã hơ nóng dưới ngọn lửa đèn cồn và để nguội, chạm nhẹ vào các vòng pellicle lấy một ít vi khuẩn cấy chuyển sang các đĩa môi trường RMR đặc đã khử trùng, ủ ở 30ºC. Sau 1- 2 ngày, chọn các khuẩn lạc nhỏ, rời nghi ngờ (khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thước) nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển nhiều lần sang các đĩa môi trường RMR đặc đã khử trùng đến khi các khuẩn lạc rời ra. Kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cấy chuyển vi khuẩn đã ròng sang ống nghiệm chứa môi trường RMR đặc, trữ ở 4ºC và được xem như là một dòng vi khuẩn.
3.3.2. Quan sát hình thái và đo kích thƣớc khuẩn lạc
Trong khi cấy chuyển vi khuẩn trên môi trường phân lập đặc, tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì có thể quan sát bằng kính lúp. Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng milimet (mm) (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.3.3. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
+ Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học: Nhỏ 15 µl nước cất vô trùng lên kính mang vật (lame), sau đó khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội, dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên kính mang vật, đậy kính đậy vật (lamelle) lên dịch huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với lame một góc 45º, rồi hạ lamelle xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho không tạo bọt khí trong mẫu vật. Quan sát mẫu vật ở độ phóng đại 400 lần, ghi nhận hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn (nếu có).
+ Nhuộm Gram vi khuẩn: Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên lame, dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên lame, sau đó hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn. Nhỏ 1-2 giọt Crystal violet lên kính, trải đều rồi để khoảng 1-2 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Iod để 1 phút, rửa mẫu vật bằng nước cất vô trùng, sau đó
rửa lại bằng cồn 70º đến khi không còn màu tím nữa. Nhỏ 1-2 giọt Fushin, trải đều để yên 1 phút và rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi mất màu của Fushin, dùng giấy thấm chấm nhẹ để khô nước. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận kết quả. Nếu tế bào vi khuẩn có màu tím xanh, vi khuẩn Gram dương vì vách tế bào ăn màu Crystal violet nên có màu tím xanh. Nếu tế bào vi khuẩn có màu hồng đỏ, vi khuẩn Gram âm vì không còn màu của Crystal violet nên có màu hồng của Fushin.
3.3.4. Xác địnhđặc tính những dòng vi khuẩn nội sinh 3.3.4.1. Khảo sát khả năng cố định đạm 3.3.4.1. Khảo sát khả năng cố định đạm
+ Nguyên tắc
Dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982), hàm lượng đạm NH4+ được đo bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter ở bước sóng 636 nm để đánh giá khả năng tổng hợp đạm của các chủng vi khuẩn theo nguyên tắc:
Trong phương pháp Indophenol, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, sau đó phản ứng với ammonium tạo thành Indophenol có màu xanh. Sự hiện diệncủa nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng lên khoảng 10 lần. Phản ứng được minh họa qua phương trình sau:
NH4+ + Phenol Hypochloride ion (môi trƣờng kiềm) Indophenol (có màu xanh)
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 1 ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 1 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng đạm tổng hợp.
+ Phƣơng pháp đo đạm (NH4 +
)
Xây dựng đường chuẩn NH4+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1- 2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 4. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 1, 2, 3, 4, 5µg/ml NH4+ (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 4: Thành phần của dãy đƣờng chuẩn NH4 +
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dich NH4+ chuẩn (1 µg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch Sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
2 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu
0,5 ml dung dịch EDTA
1 ml dung dịch Phenol - Sodium nitroprusside 2 ml dung dịch Sodium hypochloride
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng NH4+
bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 636 nm (OD636nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có NH4+ , không có màu xanh) làm mẫu đối chứng âm, blank đưa giá trị OD về 0 và tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn. Màu xanh đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn NH4+
. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD636nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD636 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+
tương đương lượng NH4+ có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
3.3.4.2. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan
+ Nguyên tắc
Để đánh giá lượng lân được hòa tan bởi vi khuẩn nội sinh, ta sử dụng thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolypdate Potassium antinomol tartrate theo nguyên lý:
Chất lân hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với Amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất Phosphomolypdate có màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H+ → (NH4)3[P(MoO10)4] Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+
bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỷ lệ thuận với hàm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg.
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 1ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng có bổ sung apatit, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 2 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày để xác định hàm lượng lân hòa tan.
+ Phƣơng pháp đo lân (P2O5)
Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2- 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 5. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml P_P2O5 (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 5: Thành phần của dãy đƣờng chuẩn P2O5
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dich P_P2O5 chuẩn (10 µg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4
Nước khử khoáng (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Tổng thể tích (ml) 12,5
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
5 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu 4 ml dung dịch B 3 ml nước khử khoáng
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng P_P2O5 bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD880nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân tương đương lượng P_P2O5 có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
Chú ý: Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu (2, 5, 10, 20, 50 lần) để hàm lượng lân đo được có giá trị chính xác.
3.3.4.3. Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 350 µl dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào tuýp eppendorf 2 ml có chứa 550 µl môi trường RMR lỏng có bổ sung tryptophan (100 µg/ml) và không bổ