3.3.4.1. Khảo sát khả năng cố định đạm
+ Nguyên tắc
Dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982), hàm lượng đạm NH4+ được đo bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter ở bước sóng 636 nm để đánh giá khả năng tổng hợp đạm của các chủng vi khuẩn theo nguyên tắc:
Trong phương pháp Indophenol, phenol và hypochlorite phản ứng trong môi trường kiềm hình thành phenylquinone-monoimine, sau đó phản ứng với ammonium tạo thành Indophenol có màu xanh. Sự hiện diệncủa nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng lên khoảng 10 lần. Phản ứng được minh họa qua phương trình sau:
NH4+ + Phenol Hypochloride ion (môi trƣờng kiềm) Indophenol (có màu xanh)
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 1 ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường Burk không đạm lỏng, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 1 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng đạm tổng hợp.
+ Phƣơng pháp đo đạm (NH4 +
)
Xây dựng đường chuẩn NH4+: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1- 2-3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 4. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 1, 2, 3, 4, 5µg/ml NH4+ (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 4: Thành phần của dãy đƣờng chuẩn NH4 +
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 2,5 2 1,5 1 0,5 0
Dung dich NH4+ chuẩn (1 µg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch EDTA (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dịch Sodium hypochloride (ml) 2 2 2 2 2 2
Tổng thể tích (ml) 6
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
2 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu
0,5 ml dung dịch EDTA
1 ml dung dịch Phenol - Sodium nitroprusside 2 ml dung dịch Sodium hypochloride
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng NH4+
bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 636 nm (OD636nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm. Sử dụng giá trị đo OD của ống 0 (không có NH4+ , không có màu xanh) làm mẫu đối chứng âm, blank đưa giá trị OD về 0 và tiến hành đo giá trị OD của 5 ống còn lại của đường chuẩn. Màu xanh đậm dần tương ứng với giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn NH4+
. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD636nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD636 nm của mẫu để tính hàm lượng đạm NH4+
tương đương lượng NH4+ có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
3.3.4.2. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan
+ Nguyên tắc
Để đánh giá lượng lân được hòa tan bởi vi khuẩn nội sinh, ta sử dụng thuốc thử acid Ascorbic Amoniummolypdate Potassium antinomol tartrate theo nguyên lý:
Chất lân hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với Amoniummolypdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất Phosphomolypdate có màu vàng.
H2PO4- + NH4+ + MoO42+ + 2H+ → (NH4)3[P(MoO10)4] Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+
bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm cho dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molypdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỷ lệ thuận với hàm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg.
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 1ml dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào ống falcon có chứa 20 ml môi trường NBRIP lỏng có bổ sung apatit, lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy 2 ml mẫu được nuôi ở thời điểm 5, 10, 15 và 20 ngày để xác định hàm lượng lân hòa tan.
+ Phƣơng pháp đo lân (P2O5)
Xây dựng đường chuẩn P2O5: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2- 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 5. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml P_P2O5 (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Bảng 5: Thành phần của dãy đƣờng chuẩn P2O5
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 5 5 5 5 5 5
Dung dich P_P2O5 chuẩn (10 µg/ml) (ml) 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Dung dịch B (ml) 4 4 4 4 4 4
Nước khử khoáng (ml) 3,5 3 2,5 2 1,5 1
Tổng thể tích (ml) 12,5
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra.
Mẫu: Mẫu được hút vào các tuýp eppendorf, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
5 ml nước khử khoáng 0,5 ml dịch mẫu 4 ml dung dịch B 3 ml nước khử khoáng
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng P_P2O5 bằng phương pháp so màu Oniani ở bước sóng 880 nm (OD880nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD880nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân tương đương lượng P_P2O5 có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
Chú ý: Nếu hàm lượng lân trong mẫu sau khi ly tâm cao hơn so với đường chuẩn lân sẽ tiến hành pha loãng mẫu (2, 5, 10, 20, 50 lần) để hàm lượng lân đo được có giá trị chính xác.
3.3.4.3. Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
+ Chuẩn bị mẫu
Chủng 350 µl dịch huyền phù vi khuẩn đã được nuôi trong môi trường RMR lỏng và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày vào tuýp eppendorf 2 ml có chứa 550 µl môi trường RMR lỏng có bổ sung tryptophan (100 µg/ml) và không bổ sung tryptophan, ủ trong tối. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy tuýp eppendorf chứa mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA tổng hợp.
+ Phƣơng pháp đo IAA
Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 6 ống nghiệm được đánh số theo thứ tự 0-1-2- 3-4-5 với ống 0 là ống đối chứng âm, lần lượt thêm các thành phần vào mỗi ống nghiệm như bảng 6. Khi đó, ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0, 10, 20, 30, 40, 50 µg/ml IAA.
Bảng 6: Thành phần của dãy đƣờng chuẩn IAA
Ống nghiệm
Hóa chất 0 1 2 3 4 5
Nước khử khoáng (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Dung dịch thuốc thử Salkowsky (ml) 1 1 1 1 1 1
Dung dich IAA chuẩn (µg/ml) (µl) 0 20 40 60 80 100
Trộn đều và để ổn định ở nhiệt độ phòng, trong tối khoảng 15-20 phút để phản ứng tạo màu xảy ra hoàn toàn.
Mẫu: các tuýp eppendorf được lấy ra, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau:
0,5 ml dịch mẫu
1 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky
Trộn đều và để ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối (Cao Ngọc Điệp, 2011).
Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530nm).
Đo giá trị OD của 6 ống nghiệm đường chuẩn để xây dựng đường chuẩn, sau đó tiến hành đo giá trị OD của các mẫu thí nghiệm.
Sử dụng phần mềm Microsoft Excel để nhập số liệu và vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn P_P2O5. Phương trình đường chuẩn có dạng: Y = a * X + b, trong đó X là nồng độ của mẫu (µg/ml), Y là độ hấp thụ quang (OD530nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn và giá trị OD530 nm của mẫu để tính hàm lượng IAA tương đương lượng IAA có trong mẫu theo công thức: X = (Y– b)/a.
3.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft Excel được sử dụng để nhập, xử lí số liệu, phân tích ANOVA và so sánh các giá trị trung bình.
CHƢƠNG 4.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 4.1.1. Phân lập vi khuẩn
Qua các giai đoạn phân lập vi khuẩn từ rễ và thân của các mẫu lúa thu từ 3 địa điểm thuộc huyện Sơn Hòa ở tỉnh Phú Yên trên môi trường nuôi cấy RMR bán đặc và đặc đã phân lập được được 26 dòng vi khuẩn. Trong đó, 13 dòng vi khuẩn được phân lập từ thân và 13 dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ. Nguồn gốc và kí hiệu của các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường RMR được trình bày trong bảng 7.
Bảng 7: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đƣợc phân lập trên môi trƣờng RMR
STT Dòng vi khuẩn Nguồn gốc cây chủ Vị trí phân lập Địa điểm lấy mẫu
1 SH1 ML 48 Thân Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
2 SH2 ML 48 Thân Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
3 SH3 ML 48 Thân Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
4 SH4 ML 68 Thân Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
5 SH5 ML 68 Thân Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
6 SH6 ML 68 Thân Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
7 SH7 ML 48 Thân Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
8 SH8 ML 4 Thân Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
9 SH9 ML 4 Thân Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
10 SH10 ML 4 Thân Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
11 SH11 ML 48 Thân Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
12 SH12 ML 68 Thân Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
13 SH13 ML 4 Thân Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
14 SH14 ML 4 Rễ Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
15 SH15 ML 4 Rễ Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
16 SH16 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
17 SH17 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
18 SH18 ML 68 Rễ Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
19 SH19 ML 68 Rễ Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
20 SH20 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
21 SH21 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
22 SH22 ML 4 Rễ Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
23 SH23 ML 4 Rễ Xã Sơn Hội, Sơn Hòa, Phú Yên
24 SH24 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
25 SH25 ML 68 Rễ Xã Sơn Nguyên, Sơn Hòa, Phú Yên
26 SH26 ML 48 Rễ Xã Sơn Hà, Sơn Hòa, Phú Yên
Ghi chú: ML: Giống lúa Ma Lâm
Các dòng phân lập được đều có chung đặc tính sinh trưởng và phát triển ở điều kiện vi hiếu khí trong môi trường RMR bán đặc, chúng phát triển hình thành lớp màng mỏng (pellicle) cách môi trường nôi khoảng 0,5cm sau 2-3 ngày nuôi (Hình 3).
Hình 3: Vòng pellicle xuất hiện cách mặt môi trƣờng RMR bán đặc 0,5 cm
4.1.2. Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập
Sau khi phân lập ròng, tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này trên đĩa môi trường RMR đặc để quan sát và mô tả khuẩn lạc. Dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều điểm khác nhau được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa và kích thước khuẩn lạc. Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 24 - 48 giờ. Hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên; một số khuẩn lạc có màu trắng trong, có độ nổi lài và bìa răng cưa. Ngoài ra, một số ít vi khuẩn còn tạo ra khuẩn lạc có một số đặc điểm như khuẩn lạc có nhân hoặc lan ra rất nhanh trên bề mặt môi trường hoặc có độ nhầy. Về tế bào vi khuẩn, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc Gram âm, có dạng hình que ngắn và chuyển động (Bảng 8).
Màng mỏng (pellicle)
Bảng 8: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng RMR STT Dòng vi khuẩn Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Đƣờng kính* (mm)
1 SH1 Que ngắn + Trắng trong, có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
2 SH2 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 1,5
3 SH3 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1
4 SH4 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
5 SH5 Que ngắn + Trắng đục Không đều Lài Răng cưa 1,5
6 SH6 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 2
7 SH7 Que ngắn + Trắng đục, có nhân Tròn đều Mô Nguyên 2
8 SH8 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1
9 SH9 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
10 SH10 Que ngắn + Trắng trong Không đều Lài Răng cưa 1
11 SH11 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1,5
12 SH12 Que ngắn + Trắng trong Không đều Lài Răng cưa 2,5
13 SH13 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1,5
14 SH14 Que ngắn + Trắng đục Không đều Lài Răng cưa 2
15 SH15 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1,5
16 SH16 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
17 SH17 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 2
18 SH18 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
19 SH19 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
20 SH20 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
21 SH21 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1,5
22 SH22 Que ngắn + Trắng trong, lan Tròn đều Mô Nguyên 1,5
23 SH23 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 2
24 SH24 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
25 SH25 Que ngắn + Trắng đục, lan Tròn đều Mô Nguyên 2
26 SH26 Que ngắn + Trắng trong, lan Tròn đều Mô Nguyên 1,5
Ghi chú: (+) chuyển động, (-) không chuyển động
4.1.2.1. Đặc điểm của khuẩn lạc
Bảng 9: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Số lƣợng Tỷ lệ (%) Màu sắc Trắng đục 14 53,85 Trắng trong 12 46,15 Hình dạng Tròn đều 22 84,62 Không đều 4 15,38 Độ nổi Mô 22 84,62 Lài 4 15,38 Dạng bìa Nguyên 22 84,62 Răng cưa 4 15,38
Màu sắc của khuẩn lạc: Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục. Trong 26 dòng vi khuẩn phân lập được, 14 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm tỉ lệ 53,85% và 12 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu trắng trong, chiếm tỉ lệ 46,15%.
Hình dạng của khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc do các dòng vi khuẩn tạo ra đều có dạng tròn, một số có dạng không đều. 22/26 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc tròn chiếm tỉ lệ 84,62% và 4/26 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc không đều chiếm tỉ lệ 15,38%.
Độ nổi của khuẩn lạc: Trong số 26 dòng vi khuẩn phân lập đươc thì 22 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có độ nổi mô chiếm đa số với dòng chiếm tỉ lệ 84,62%, còn lại 4 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có độ nổi lài chiếm tỉ lệ 15,38%.
Dạng bìa của khuẩn lạc: Hầu hết dạng bìa của khuẩn lạc là bìa nguyên với 22/26