Sau khi phân lập ròng, tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này trên đĩa môi trường RMR đặc để quan sát và mô tả khuẩn lạc. Dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều điểm khác nhau được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa và kích thước khuẩn lạc. Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 24 - 48 giờ. Hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên; một số khuẩn lạc có màu trắng trong, có độ nổi lài và bìa răng cưa. Ngoài ra, một số ít vi khuẩn còn tạo ra khuẩn lạc có một số đặc điểm như khuẩn lạc có nhân hoặc lan ra rất nhanh trên bề mặt môi trường hoặc có độ nhầy. Về tế bào vi khuẩn, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc Gram âm, có dạng hình que ngắn và chuyển động (Bảng 8).
Màng mỏng (pellicle)
Bảng 8: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng RMR STT Dòng vi khuẩn Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Độ nổi Dạng bìa Đƣờng kính* (mm)
1 SH1 Que ngắn + Trắng trong, có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
2 SH2 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 1,5
3 SH3 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1
4 SH4 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
5 SH5 Que ngắn + Trắng đục Không đều Lài Răng cưa 1,5
6 SH6 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 2
7 SH7 Que ngắn + Trắng đục, có nhân Tròn đều Mô Nguyên 2
8 SH8 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1
9 SH9 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
10 SH10 Que ngắn + Trắng trong Không đều Lài Răng cưa 1
11 SH11 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1,5
12 SH12 Que ngắn + Trắng trong Không đều Lài Răng cưa 2,5
13 SH13 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1,5
14 SH14 Que ngắn + Trắng đục Không đều Lài Răng cưa 2
15 SH15 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1,5
16 SH16 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
17 SH17 Que ngắn + Trắng trong, nhầy Tròn đều Mô Nguyên 2
18 SH18 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
19 SH19 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
20 SH20 Que ngắn + Trắng đục,có nhân Tròn đều Mô Nguyên 1,5
21 SH21 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 1,5
22 SH22 Que ngắn + Trắng trong, lan Tròn đều Mô Nguyên 1,5
23 SH23 Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Mô Nguyên 2
24 SH24 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Mô Nguyên 1
25 SH25 Que ngắn + Trắng đục, lan Tròn đều Mô Nguyên 2
26 SH26 Que ngắn + Trắng trong, lan Tròn đều Mô Nguyên 1,5
Ghi chú: (+) chuyển động, (-) không chuyển động
4.1.2.1. Đặc điểm của khuẩn lạc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 9: Tỷ lệ phần trăm về các đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Số lƣợng Tỷ lệ (%) Màu sắc Trắng đục 14 53,85 Trắng trong 12 46,15 Hình dạng Tròn đều 22 84,62 Không đều 4 15,38 Độ nổi Mô 22 84,62 Lài 4 15,38 Dạng bìa Nguyên 22 84,62 Răng cưa 4 15,38
Màu sắc của khuẩn lạc: Đa số các dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục. Trong 26 dòng vi khuẩn phân lập được, 14 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu trắng đục, chiếm tỉ lệ 53,85% và 12 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc màu trắng trong, chiếm tỉ lệ 46,15%.
Hình dạng của khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc do các dòng vi khuẩn tạo ra đều có dạng tròn, một số có dạng không đều. 22/26 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc tròn chiếm tỉ lệ 84,62% và 4/26 dòng vi khuẩn có dạng khuẩn lạc không đều chiếm tỉ lệ 15,38%.
Độ nổi của khuẩn lạc: Trong số 26 dòng vi khuẩn phân lập đươc thì 22 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có độ nổi mô chiếm đa số với dòng chiếm tỉ lệ 84,62%, còn lại 4 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có độ nổi lài chiếm tỉ lệ 15,38%.
Dạng bìa của khuẩn lạc: Hầu hết dạng bìa của khuẩn lạc là bìa nguyên với 22/26 dòng chiếm tỉ lệ 84,62%, chỉ có 4 dòng vi khuẩn tạo khuẩn lạc có dạng bìa răng cưa chiếm tỉ lệ 15,38%.
Kích thước của khuẩn lạc: Phần lớn khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập được có đường kính dao động từ 1-2,5 mm sau khi cấy trên môi trường RMR đặc, ủ ở 30ºC trong 24 giờ.
Hình 4: Đặc điểm của một số khuẩn lạc phân lập trên môi trƣờng RMR
a) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng không đều, độ nổi lài và bìa răng cưa
b) Khuẩn lạc có màu trắng trong, dạng tròn, độ nổi mô và bìa nguyên
c) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng tròn đều, độ nổi mô và bìa nguyên
4.1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn
Đặc điểm hình thái và khả năng chuyển động của các dòng vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần đều cho kết quả Gram âm, dạng que ngắn và có khả năng chuyển động chiếm tỉ lệ 100%.
a) b)
4.2. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn
Để đánh giá chính xác khả năng cố định đạm của từng dòng vi khuẩn, tiến hành định lượng lượng NH4+
do những dòng vi khuẩn này tạo ra. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo. Những mẫu có màu xanh càng đậm thì mức hấp thu quang phổ càng lớn và khả năng tổng hợp đạm càng cao và ngược lại.
Tất cả 26 dòng vi khuẩn có hàm lượng đạm khá cao vàkhác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% giữa các dòng vi khuẩn. Điều này chứng tỏ tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp đạm từ nito tự do.
Khả năng tổng hợp NH4+
của vi khuẩn có sự biến động theo thời gian. Sau hai ngày chủng vi khuẩn, cả 26 dòng vi khuẩn khảo sát đều có khả năng tổng hợp NH4+ với hàm lượng nhất định. Sau đó, phần lớn các dòng vi khuẩn tạo ra lượng NH4+
tăng dần và đạt nồng độ đạm tổng hợp cao nhất ở ngày 4, sau đó giảm dần đến ngày 8. Tuy nhiên, lượng đạm tổng hợp của 5 dòng vi khuẩn là SH1, SH5, SH8, SH13 và SH18 tăng dần từ ngày 2 đến ngày 6 và đạt hàm lượng cao nhất ở ngày 6, sau đó giảm dần ở ngày 8. Đối với 3 dòng SH12, SH14 và SH19 thì hàm lượng đạm tổng hợp đạt cao nhất ở ngày 2, sau đó giảm dần đến ngày 8. Đối với các dòng SH2, SH4 và SH10 thì hàm lượng đạm tổng hợp ở ngày 4 giảm so với ngày 2, sau đó tăng ở ngày 6 và giảm ở ngày 8, trong đó 2 dòng SH2, và SH10 đều đạt nồng độ cao nhất ở ngày 2, còn dòng SH4 đạt nồng độ cao nhất ở ngày 6. Lượng đạm cao nhất được dòng SH22 tổng hợp (4,175 µg/ml) ở ngày 4 vàlượng đạm thấp nhất do dòng SH4 tổng hợp (1,101 µg/ml) cũng ở ngày 4 (Bảng 10).
Ở những ngày đầu, vi khuẩn phát triển khá mạnh nên lượng NH4+
tổng hợp nhiều. Khi lượng đạm tổng hợp quá nhiều mà không được cây sử dụng sẽ ức chế lại sự phát triển của vi khuẩn dẫn đến vi khuẩn ngưng tổng hợp đạm và sử dụng lượng đạm tổng hợp được đến khi lượng đạm trong môi trường không còn không còn ức chế vi khuẩn nữa thì vi khuẩn sẽ tiếp tục tổng hợp đạm. Đến ngày 8, lượng đạm do các dòng vi khuẩn tổng hợp đều giảm do môi trường nuôi không còn thuận lợi như trước: chất dinh dưỡng còn ít và tích lũy nhiều chất thải nên vi khuẩn hoạt động kém và thậm chí nhiều tế bào vi khuẩn bị chết. Bên cạnh đó, do lượng chất dinh dưỡng không còn đủ nên vi khuẩn sử dụng chính lượng NH4+
Kết quả đạm tổng hợp này cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà (2008) về khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh trong cây cỏ chăn nuôi phân lập trên môi trường RMR (0,953 µg/ml ), kết quả nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở rễ cây bắp (0,87 µg/ml) của Trần Thị Leckhana (2012) và kết quả nghiên cứu vi khuẩn nội sinh phân lập ở cây Cúc Xuyên Chi trên môi trường RMR của Lương Thị Hồng Hiệp (2010) với 0,41 µg/ml. Tuy nhiên, kết quả này lại thấp hơn rất nhiều so với kết quả nghiên cứu vi khuẩn nội sinh phân lập ở cây Cúc Xuyên Chi trên môi trường Nfb của Lương Thị Hồng Hiệp (2010) với hàm lượng đạm cao nhất đạt 6,62 µg/ml.
Bảng 10: Khả năng tổng hợp NH4 +
của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng RMR sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày chủng
STT Dòngvi khuẩn Hàm lƣợng NH4
+
trung bình (µg/ml)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8
1 SH1 1,402h 1,903k 3,310e 1,150gh 2 SH2 1,222j 1,178q 1,197q 1,114h 3 SH3 1,488g 1,624m 1,246p 1,123gh 4 SH4 1,102k 1,101r 1,464m 1,263fgh 5 SH5 1,338i 1,345p 3,965a 3,194a 6 SH6 1,334i 3,468d 1,714kl 1,552ef 7 SH7 1,887e 2,126j 1,415n 1,127gh 8 SH8 1,106k 1,229q 1,803j 1,412efgh 9 SH9 1,411h 3,918b 3,601b 2,213bc 10 SH10 2,609a 1,723l 1,731k 1,127gh 11 SH11 1,660f 2,078j 1,318o 1,109h 12 SH12 2,304b 1,525n 1,314o 1,172gh 13 SH13 1,329i 1,371p 3,488c 2,529b 14 SH14 2,269b 1,602m 1,480m 1,430efgh 15 SH15 1,926d 2,211i 2,179i 2,009cd 16 SH16 1,484g 3,545c 2,393g 1,683de 17 SH17 1,106k 1,332p 1,197q 1,145gh 18 SH18 1,943d 2,280h 2,696f 1,525ef 19 SH19 2,132c 1,898k 1,832j 1,163gh 20 SH20 2,617a 3,305f 2,656f 1,114h 21 SH21 2,106c 2,670g 2,268h 1,154gh 22 SH22 1,338i 4,175a 3,375d 1,448efg 23 SH23 1,231j 1,444o 1,246p 1,249fgh 24 SH24 1,325i 1,380p 1,318o 1,371efgh 25 SH25 1,913de 2,632g 1,682l 1,136gh 26 SH26 1,317i 3,403e 3,290e 1,163gh CV % = 4,207; LSD.01 = 0,082 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: Các giá trịtheo sau bởi các chữ cái giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không ý nghĩa ở 1% theo kiểm định LSD
Sau 2 ngày chủng, các dòng vi khuẩn tổng hợp được lượng đạm tương đối cao. Trong đó, các dòng SH10, SH12, SH14, SH19, SH20 và SH21 là các dòng có hàm lượng đạm tổng hợp cao nhất (2,106 - 2,617 µg/ml) và các dòng SH4, SH8 và SH17 là các dòng sinh ra lượng đạm thấp nhất (1,102 - 1,106 µg/ml).
Sau 4 ngày, hàm lượng đạm tổng hợp của phần lớn các vi khuẩn tăng hơn so với ngày 2 và đạt mức cao nhất.Tuy nhiên, 6 dòng vi khuẩn là SH2, SH4, SH10, SH12, SH14 và SH19 có lượng đạm giảm xuống so với ngày 2. Ở ngày 4, dòng SH22 tổng
hợp được lượng đạm cao nhất với 4,175 µg/ml và dòng SH4 có lượng đạm thấp nhất với 1,101 µg/ml.
Sau 6 ngày, đa số các dòng vi khuẩn đều có lượng đạm giảm so với ngày 4, ngoại trừ các dòng vi khuẩn SH1, SH2, SH4, SH5, SH8, SH10, SH13 và SH18 có lượng đạm tăng so với ngày 4. Ở ngày 6, dòng SH5 có lượng đạm tổng hợp cao nhất với 3,965 µg/mlvà2 dòng SH2 và SH17 đều có lượng đạm nhỏ nhất với 1,197 µg/ml.
Sau 8 ngày chủng, lượng đạm tổng hợp của tất cả các dòng vi khuẩn đều giảm. Ở ngày 8, dòng SH5 có lượng đạm tổng hợp cao nhất với 3,194 µg/ml vàdòng SH11 có lượng đạm nhỏ nhất vớ 1,109 µg/ml.
Từ các kết quả trên thấy rằng 4 dòng vi khuẩn SH9, SH15, SH16 và SH18 tổng hợp được lượng đạm khá cao và tương đối đồng đều giữa các ngày.
Hình 5: Lƣợng đạm tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo ngày sau khi chủng
Lượng đạm tổng hợp trung bình của tất cả các dòng vi khuẩn theo từng ngày sau khi chủng khác biệt rất có ý nghĩa ở mức 1% theo kiểm định LSD. Lượng đạm tăng dần đến ngày 4 và bắt đầu giảm dần đến ngày 8. Lượng đạm đạt cao nhất ở ngày 4, theo sau lần lượt là ngày 6 và ngày 2 và đạt thấp nhất ở ngày 8 (Hình 5).