Thân rễ khô Gừng Zingiber sp. (370g)
1. Ngâm chiết 3 lần với ethanol 96o
ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 3 ngày 2. Lọc bằng phễu lọc Buchner, gộp dịch lọc
3. Cất loại ethanol đến khi dịch cịn 0.5 lít, pha lỗng dịch chiết với 0.2 lít nƣớc muối 10%
Dịch ethanol- nƣớc
Chiết bằng n-hexan
Dịch n-hexan
1. Làm khô 2. Loại dung môi
Dịch ethanol- nƣớc Chiết bằng Cloroform Cặn chiết n-hexan (H) 8 (g) 2.162% Dịch chiết cloroform 1. Làm khô 2. Loại dung môi
Cặn chiết Cloroform (C) 7.1(g) 1.918%
Chiết bằng Etylaxetat
1. Làm khô
2. Loại bỏ dung môi
Dịch chiết Etylaxetat Dich ethanol-
nƣớc
Dịch chiết Etylaxetat (E) 0.6(g) 0.162%
55
Bảng 3.9. Hiệu suất của các chiết thu đƣợc từ thân rễ cây Gừng Zingiber sp.
Cặn chiết n- hexan Cloroform Ethylaxetat
Hiệu suất (%) 2.162 1.918 0.162
Kết quả trên cho thấy các hợp chất chiết đƣợc trong thân rễ cây Gừng Zingiber
sp. chủ yếu là các chất ít phân cực tan trong n-hexan (cặn H). Sau đó là các hợp chất
có độ phân cực mạnh hơn tan trong cloroforom (cặn C) và các hợp chất tan trong dung môi phân cực mạnh ethylaxetat (E) là thấp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với tỷ lệ các cặn chiết trong thân rễ tƣơi của cây Gừng lông hung.
3.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các cặn chiết thu đƣợc
Phép thử định tính sinh học (Bioassay guioded test) là phƣơng pháp tốt nhất để tìm kiếm các chất sinh học trong thực vật. Vì vậy chúng tôi sử dụng phƣơng pháp này để thăm dị các chất có hoạt tính sinh học trong cặn chiết từ thân rễ cây Gừng Zingiber sp.
Các cặn chiết H, C và E đã đƣợc thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại phòng sinh học thực nghiệm, Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên đối với 8 loại vi sinh vật kiểm định đại diện cho 4 nhóm: 2 khuẩn Gram (-), 2 khuẩn Gram (+), 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men. kết quả chỉ ra trên bảng 3.10.
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của các cặn chiết thân rễ Gừng Zingiber sp.
stt Kí hiệu mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)
Vi khuẩn Gram (-)
Vi khuẩn Gram (+)
Nấm mốc Nấm men
E.coli P.aeruginosa B.subtillis S.aureus A.niger F.oxysporum S.cerevisiae C.albicans
1 Cặn H 200 (-) 200 200 (-) (-) (-) (-)
2 Cặn C 100 (-) 100 100 (-) (-) (-) (-)
56
Kết quả trên cho thấy chỉ có cặn chiết bằng n-hexan (H) và cặn chiết bằng cloroform (C) có hoạt tính kháng 3 trong 8 vi sinh vật đƣợc thử. Trong đó cặn C có tác động mạnh hơn cặn H nhiều.
Đây là một định hƣớng tốt cho việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính chống gây bệnh tiêu chảy do (E.coli) gây ra va gây bệnh viêm nhiễm ruột già do
B.subtillis gây ra.
3.2.3. Phân tích thành phần cặn chiết hexan (H) của Gừng Zingiber sp. bằng
sắc kí khí (GC-MS).
Cặn hexan có dạng lỏng, gồm các chất kém phân cực nên có thể phân tích thành phần và phân biệt chúng bằng GC-MS.
Nhƣ phần thực nghiệm đã trình bày, chúng tơi đã chọn đƣợc phƣơng pháp phân tích tối ƣu và đã phát hiện đƣợc 20 chất chính trong cặn hexan. Bằng cách so sánh khối phổ của các chất thu đƣợc với khối phổ của thƣ viện phổ trong máy, chúng tôi nhận biết đƣợc 14 chất với độ trùng lặp trên 85%. Kết quả và sắc kí đồ đƣợc trình bày trong bảng 3.11.
57
Bảng 3.11. Thành phần hoá học của cặn H Gừng Zingiber sp.
STT RT (min) Tên chất Hàm lƣợng (%) Độ lặp (%) 1 8.07 1,8-Cineole 1.27 94 2 10.21 Linalool 55.96 90 3 12.36 Borneol 4.82 94 4 16.29 Bornyl acetate 1.10 90 5 17.97 δ- Elemene 1.24 90 6 19.73 - Elemene 2.19 91 7 22.50 D- Geramcrene 5.72 97 8 23.31 -Bisabolene 3.34 95 9 23.76 - Cadinene 1.24 96 10 24.57 Elemol 6.03 86 11 24.75 - Elemene 1.39 91 12 26.66 trans- Asarone 5.37 98 13 27.59 Valencene 2.70 95 14 36.26 Ethyl hexadecanoate 1.02 95 15 Chƣa nhận dạng 6.61
Kết quả trên cho thấy số lƣợng hợp chất đã nhận dạng đƣợc chiếm đến 93,39%. Chất chƣa nhận dạng đƣợc chỉ chiếm 6.61 %. Trong tất cả các chất đã nhận dạng đƣợc có linalool có hàm lƣợng lớn nhất (55.96%). Sau đó là Elemol (6.03%), D- Geramcrene (5.72%), trans- Asarone (5.30%) và -Bisabolene (4.82%) cịn lại
các chất có hàm lƣợng từ 1 đến 3.5%.
Trong các thành phần chính đáng chú ý là linalool và trans-Asarone. Linalool là một hƣơng liệu quí dùng rất phổ biến trong công nghiệp mỹ phẩm, hƣơng liệu. còn trans-Asarone là một tác nhân chống bệnh sỏi mật và chống co giật.
58
KẾT LUẬN
Để góp phần đánh giá giá trị khoa học và thực tiễn của cây trồng đặc hữu Việt nam, thuộc nguồn gen q hiếm theo quyết định của bộ NNPTTN. Chúng tơi tiến hành nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây Gừng lơng hung (Zingiber rufopilosum Gagn.). Để góp phần hồn chỉnh nghiên cứu hố thực vật chi gừng (Zingiber) thuộc họ gừng (Zingiberaceae). Chúng tơi tìm kiếm các lồi mới thuộc chi này đó là cây Gừng Zingiber sp. tìm thấy ở vùng cao thuộc tỉnh Lâm
Đồng và nhƣ thế chúng tơi là ngƣời đầu tiên nghiên cứu hố học và các hợp chất sinh học của 2 loài cây này. Kết quả nghiên cứu đƣa đến các kết luận sau:
1. Đã xây dựng đƣợc qui trình chiết chọn lọc các chất trong thân rễ cây Gừng lông hung ( Zingiber rufopilosum Gagn.) và cây Gừng Zingiber sp theo độ phân cực tăng dần của dung môi n-hexane, cloroform và etylaxetat và thu đƣợc các cặn chiết tƣơng ứng H,C và E.
2. Đã khảo sát hoạt tính kháng tám loại vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết H, C và E. Kết quả cho thấy cặn C của cây Gừng lông hung kháng 2 loại nấm men
S.cerevisiae và C.albicans, cặn C và H của cây gừng Zingiber sp. kháng với vi
khuẩn tiêu chảy gram (+) Ecoli và vi khuẩn gây viêm gram (-)B.subtillis và S.aureus.
3. Từ các cặn chiết của cây gừng lông hung chúng tôi phân lập và xác định cấu trúc phân tử của 3 chất: β-sitosterol; 1,2-di- (Z,Z,Z)-hexadeca-7,10,13-trienoyl glycerol và zerumbone. Zerumbone chiếm 0,002% nguyên liệu tƣơi thấp hơn so với gừng gió (0.7%). Những chất này lần đầu tiên đƣợc chúng tôi phân lập từ cây gừng lông hung.
4. Đã phân tích cặn chiết n-hexan của cây Gừng Zingiber sp. và nhận biết đƣợc 14 thành phần chiếm 93,39% Đáng chú ý thành phần linalool là một hƣơng liệu quí chiếm 55,96% và thành phần trans-Asarone có tác dụng chống bệnh sỏi mật và co giật chiếm 5,30%.
Rõ ràng còn rất nhiều vấn đề cần nghiên cứu trong 2 lồi cây này đặc biệt là chất có hoạt tính kháng khuẩn nằm trong 2 cặn chiết C và H của thân rễ cây gừng
Zingiber sp., vì phép thử sinh học cho thấy 2 cặn này có tính kháng khuẩn tốt. Đó là
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam. Tr 536, NXB Y học.
2. Võ Văn Chi, Dƣơng Đức Tiến (1987), Phân loại thực vật, thực vật bậc cao, tr 461- 464, NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp , Hà Nội
3. Trịnh Đình Chính (1995), Nghiên cứu thành phần hoá học của tinh dầu một số cây thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam, Luân án PTS Khoa học và hoá học, Trƣờng ĐH Sƣ phạm Hà Nội.
4. Trịnh Đình Chính, Hồng Triệu Hùng, Nguyễn Thị Hoàng Anh, bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hoá học của cây Gừng dại (Zingiber cassumunar
Roxb) ở tỉnh Kon Tum, tạp chí Dƣợc liệu, tập 12, số 3+4/2007, trang 89-91.
5. Dƣợc điển Việt Nam, Bộ y tế, xuất bản lần thứ 3, NXB Y học, tr 368-369 6. Phan Minh Giang, Luận án tiến sĩ hóa học, (1999), trang 63
7. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, in lần thứ 2, quyển 3, tr 447. 8. Văn Ngọc Hƣớng và CS, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, (2006), Vol. 44,
trang 65-69
9. Nguyễn Thị Mai: Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây gừng .
Z.officinale Rose ở Văn Lâm- Hƣng Yên, luận văn thạc sĩ ĐHSPHN (2004).
10. Lã Đình Mỡ, Lƣu Đàm Cƣ, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Ninh Khắc Bản (2002) Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, tập 2, tr 90-119), NXB
Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội.
Tiếng Anh
11. Abdul A.B.H. etal.; (2008), Anticancer activity of natural compound zerumbone extracted from Zingiber zerumbet in Human Hela cervical cancer cells. International Journal of Pharmacology, 4; pp160-168.
60
13. Bokyung Sung et al.; (2008), Zerumbone downregulates chemokine receptor CXCR-4 expression leading to inhibition CXCL-12 induced invasion of breast and pacreatic tumor cells. Cancer Res., 68, pp8938 -8944.
14. Buckingham J (1982), Dictionary of Organic compounds, New York- London- Toronto, Chapman and Hall, 5, pp 5763.
15. Dung.N.X., Chinh.T.D., Piet A.Leclereq (1995), “Chemical investigation of the acrial part of Zingiber zerumbet (L) Sm. From Vietnam”, Jour.Essent. Oil Res. (USA), 7(2), pp 153-157.
16. G.Vlahov, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectrocopy (1999), Vol.35, pp 341-357.
17. G. Knothe et al., Eur. J. Lipid Sci. Technol., (2004), Vol. 106, pp 88-96. 18. G. knothe, wwwlipidlibraryCo.Uk.pag 8
19. Huang Guan –Cheng et al.;(2004);Antitumor effect of zerumbone from zingiber zerumbet in P-388D cells in vitro and in vivo. Planta medica. 7, pp219-224.
20. Kanamura K. et al.;(2006); Zerumbone a sesquiterpenein subtropical supressesskin tumor initiation and pronotion stages in ICR mice. International tournal of canncer, 6, pp214-218.
21. Kim M, Miyamoto S, Yasui Y, Oyama T, Murakami A, Tanaka T. (2009), Zerumbone, a tropical ginger sesquiterpene, inhibits colon and lung carcinogenesis in mice. Int. J. Cancer. 15;124(2):pp264-71.
22. Matthes.H.W.D., Luu.B., Ourisson.G (1980), “Cytotoxic componentsn of Zingiber Zerumbet, curcuma zedoaria and C. domestica” (1980), Phytochemsitry, 19, pp2643-2650.
23. Masuda.T., Jitoe.A., Kato.S., Nakatani.N (1991), “Acetylated flavonol glycosides from Zingiber zerumbet”, Phytochemsitry, 30, pp2391-1392.
24. Murakami A. et al.; (2003); The anticancer properties of zerumbone. Biochem. Pharmacol. 16;pp1253-1261.
61
25. Laurence Voutquenen…Cytotoxic poliisoprenes and glycozides of long- chain fatty alcohohls from Dimocarpus fusmatus.
Phytochemistry.50.(1999),pp63-69.
26. Sharifah Sakinah et al.; (2007); Zerumbone induced apoptosis of Bax/Bel-2 ratio. Cancer cell intrenational, 7, pp1186-1475.
27. Ovierose.M.B, Catoria M.C.Pharmacognostical Studion Z.zezumbet.L>and its propset variety (family Zingiberaceae) Philipp.J.Sci, 111.(3-4), pp99-123 (1982).
28. Vimala.S., Norhanom.A.W., Yada.M (1999), “ Anti-tumour promoter activity in Malaysian ginger rhizobia used in traditional medicine”, British journal of cancer, 80, pp110-116.
62 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: PHỔ IR CỦA ZR5 PHỤ LỤC 2 PHỔ MS CỦA ZR5 PHỤ LỤC 3: PHỔ 1H-NMR CỦA ZR5 PHỤ LỤC 3.1, 3.2: PHỔ GIÃN 1 H-NMR CỦA ZR5
PHỤ LỤC 3.3: PHỔ 1H-NMR CỦA METHYL 9,12,15-OCTADECATRIENOAT
PHỤ LỤC 4: PHỔ 13C-NMR CỦA ZR5 PHỤ LỤC 4.1, 4.2: PHỔ GIÃN 13 C-NMR CỦA ZR5 PHỤ LỤC 5: PHỔ DEPT CỦA ZR5 PHỤ LỤC 5.1: PHỔ GIÃN DEPTCỦA ZR5 PHỤ LỤC 6: PHỔ HMBC CỦA ZR5 PHỤ LỤC 6.1, 6.2, 6.3: PHỔ GIÃN HMBC CỦA ZR5 PHỤ LỤC 7: PHỔ HSQC CỦA ZR5 PHỤ LỤC 7.1, 7.2: PHỔ GIÃN HSQC CỦA ZR5 PHỤ LỤC 8 : PHỔ IR CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 9 : PHỔ MS CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 10 : PHỔ 1H-NMR CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 10.1 : PHỔ 1H-NMR CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 11 : PHỔ 13 C-NMR CỦA ZRE22
PHỤ LỤC 11.1, 11.2 : PHỔ GIÃN 13C-NMR CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 12: PHỔ DEPT CỦA ZRE22
PHỤ LỤC 12.1: PHỔ GIÃN DEPT CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 13: PHỔ HMBC CỦA ZRE22
PHỤ LỤC 13.1, 13.2, 13.3, 13.4 : PHỔ GIÃN HMBC CỦA ZRE22 PHỤ LỤC 14: PHỔ HSQC CỦA ZRE22