2.3.2.3 .Phân lập các chất có trong các cặn chiết H,C và E
3.1.3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật các cặn chiết từ thân rễ gừng cây
Cặn chiết n- hexan Cloroform Ethylaxetat
Hiệu suất (%) 0.143 0,047 0,023
Kết quả trên cho thấy các hợp chất chiết đƣợc trong thân rễ cây Gừng lông hung chủ yếu là các chất ít phân cực, tan trong n-hexan (cặn H), sau đó là các hợp chất có độ phân cực mạnh hơn tan trong cloroforom (cặn C) và ít hơn hẳn là các hợp chất tan trong dung môi phân cực mạnh ethylaxetat (E).
3.1.3. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật các cặn chiết từ thân rễ gừng cây gừng lông hung gừng lơng hung
Vi khuẩn thì ln ln biến đổi, kháng thuốc để tồn tại, con ngƣời thì ln ln tìm thuốc mới để chống lại vi khuẩn để bảo vệ mình và phát triển. Vì vậy cuộc chiến giữa con ngƣời và vi khuẩn là cuộc chiến lâu dài khơng có hồi kết. Chúng tơi qua tâm, tìm kiếm các chất diệt vi khuẩn mới vì vậy tiến hành thử nghiệm hoạt tính chống tám loại vi sinh vật kiểm định của cặn H, C và E từ thân rễ gừng lông hung và kết quả chỉ ra trên bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật các cặn chiết thân rễ
gừng lơng hung
stt Kí hiệu mẫu
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml
Vi khuẩn Gram (-) Vi khuẩn Gram (+) Nấm mốc Nấm men
E.coli P.aeruginosa B.subtillis S.aureus A.niger F.oxysporum S.cerevisi
ae C.albican s 1 Cặn H (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 Cặn C (-) (-) (-) (-) (-) (-) 200 200 3 Cặn E (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Kết quả trên cho thấy trong thân rễ cây gừng lông hung hầu nhƣ khơng có các hợp chất kháng khuẩn. Nhƣng có các hợp chất kháng nấm men ở trong cặn chiết kém phân cực của dung môi cloroform.
44
3.1.4. Khảo sát các cặn chiết của thân rễ gừng lơng hung bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM).
Để bƣớc đầu tìm kiếm các lớp chất trong các cặn chiết đã thu đƣợc chúng tôi tiến hành khảo sát các cặn này bằng sắc kí lớp mỏng và thuốc thử đặc trƣng:
Vanillin/H2SO4 đặc 0.2% đặc trƣng cho các tecpenoit, steroit, saponin… Dragendorff đặc trƣng cho các ankanoit
FeCl3 1M nguội đặc trƣng cho fravonoit, phenolic, axit cacboxylic
FeCl3 1M nóng đặc trƣng cho các ester và lacton.
Qua quá trình thực nghiệm với nhiều hệ dung mơi khác nhau chúng tôi đã chọn các hệ dung mơi thích hợp để khảo sát các cặn chiết H, C và E bằng sắc kí lớp mỏng và kết quả đã đƣợc chỉ ra trên bảng 3.2, 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3. Kết quả SKLM cặn chiết n-hexan.
TT Rf
Màu sắc phổ
Vanilin/H2SO4 Dragendorff FeCl3 1M Nguội
FeCl3 1M Nóng
1 0,96 Hồng tƣơi (hơ nóng) không màu Không màu Không màu
2 0,67 Nâu (hơ nóng) Không màu Không màu Không màu
3 0,59 Tím (hơ nóng) Khơng màu Không màu Không màu
4 0,42 Nâu nhạt (hơ nóng) Khơng màu Khơng màu Không màu
5 0,13 Xanh (hơ nóng) Khơng màu Khơng màu Khơng màu
6 0,06 Xanh đậm (hơ nóng) Khơng màu Không màu Không màu
Bảng 3.4. Kết quả SKLM cặn chiết Cloroform.
TT Rf
Màu sắc phổ
Vanilin/H2SO4 Dragendorff FeCl3 1M Nguội
FeCl3 1M Nóng
45
2 0,89 Hồng đậm Không màu Không màu Không màu
3 0,75 Hồng nhạt Không màu Không màu Không màu
4 0,48 Tím Khơng màu Xanh đen Xanh đen
5 0,17 Xanh đậm Không màu Không màu Không màu
Bảng 3.5. Kết quả SKLM cặn chiết E .
TT Rf
Màu sắc phổ Vanilin/H2SO4 Dragendorff FeCl31M
Nguội
FeCl31M Nóng
1 0,86 Hồng tƣơi Khơng màu Không màu Xanh đen
2 0,81 Vàng Không màu Không màu Không màu
3 0,64 Hồng tƣơi Không màu Không màu Xanh đen
4 0,47 Tím Khơng màu Khơng màu Khơng màu
Kết quả trên cho thấy cặn không phân cực (H) có thành phần phức tạp nhất, 6 thành phần trong đó khơng có ankanoit, fravonoit, phenolic. Cặn C khơng có ankanoit, fravonit nhƣng có 1 ester hay lacton cịn cặn E khơng có ankaloit, fravonoit, phenolic nhƣng có 2 ester hay lacton.
3.1.5. Phân lập các chất có trong cặn chiết H, C, E.
Phƣơng pháp phân lập có hiệu quả các chất tinh khiết trong một hỗn hợp phức tạp là phƣơng pháp sắc kí. Đối với phƣơng pháp sắc kí cột thƣờng việc lựa chọn dung môi rửa giải cột là quan trọng nhất , có nhiều cách rửa giải; rửa giải cột bằng hệ dung mơi có độ phân cực thay đổi (Gradient theo tỷ lệ các dung môi trong hỗn hợp rửa), rửa giải cột bằng 1 hệ dung môi xác định nghĩa là tỷ lệ các dung môi trong hỗn hợp rửa là không đổi (độ phân cực của dung môi rửa là xác định). Mỗi phƣơng pháp giải hấp các chất trên cột có một ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Chúng tôi chọn phƣơng pháp rửa giải hấp các chất trên cột bằng một hệ dung mơi có độ
46
phân cực xác định (tỷ lệ các dung môi trong hỗn hợp là cố định). Để chọn đƣợc một hệ dung môi rửa một cách khoa học chúng tơi dùng phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) nghĩa là chọn một hệ dung môi sao cho khi khảo sát hỗn hợp định phân tách trên cột bằng SKLM cho một sắc phổ tốt nhất, một sắc phổ mà các chất mong muốn phân tách có ΔRf so với các chất khơng muốn phân tách càng lớn càng tốt.
3.1.5.1. phân lập các chất có trong cặn H.
Bằng sắc ký cột (SKC) trên silica gel cỡ hạt 0.040-0.063 mm, hệ dung môi rửa là n-hexan: EtOAc 8:2 (v/v) và tỷ lệ chất phân tách trên chất hấp phụ là 1/40 theo trọng lƣợng. Từ 6(g) cặn C chúng tôi tiến hành phân lập các chất trong cặn này. Việc phân lập đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.2.
Sơ đồ 3.2. Tách các chất tinh khiết trong cặn H
Từ phân đoạn H4, tinh chế lại trên cột có kích thƣớc nhỏ hơn và hệ rửa giải thích hợp chúng tơi thu đƣợc chất rắn vơ định hình, nóng chảy 135-136 o
C có Rf = 0,70 với hệ dung mơi n-hexan/EtOAc, 8/2 (v/v), Kí hiệu ZRH4.
Cặn H (6g)
H1 H2 H3 H4 H5 H6
ZRH4
Tinh chế trên cột nhỏ với hệ rửa giải n-hexan: EtOAc 8/2 (v/v)
Phân lập trên cột với hệ rửa giải n-hexan: EtOAc 8:2 (v/v)
47
3.1.5.2. phân lập các chất trong cặn C.
Tiến hành phân lập các chất trong cặn C trên silicagel cỡ hạt 0.040-0.063 mm, hệ dung môi rửa giải CHCl3/Aceton, 8/2 (v/v), việc phân lập đƣợc thực hiện trên sơ đồ 3.3.
Sơ đồ 3.3. Tách các chất tinh khiết trong cặn C
Từ phân đoạn T5 tinh chế lại thu đƣợc đƣợc 1 chất tinh khiết ở dạng dầu kí hiệu ZR5 có Rf=0,75 với hệ dung môi CHCl3/Aceton, 8/2 (v/v).
3.1.5.3. Phân lập các chất trong cặn E
Tiến hành phân lập các chất trong cặn E trên silicagel cỡ hạt 0.040-0.063 mm, hệ dung môi rửa giải EtOAc/CHCl3, 8/2 (v/v), việc phân lập đƣợc thực hiện trên sơ đồ 3.4.
Tinh chế trên cột nhỏ với hệ rửa giải CHCl3:Aceton 7:3(v/v)
Cặn C (2g)
T1 T2 T3 T4 T5 T6
ZR5
Phân lập trên cột với hệ rửa giải CHCl3:Aceton 8:2(v/v)
48
Sơ đồ 3.4. Tách chiết các chất tinh khiết trong cặn E
Từ cặn E chúng tơi phân lập đƣợc một chất có dạng tinh thể hình kim, màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 66-67 oC, ký hiệu ZRE2.2 có Rf = 0,73 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc, 9/1 (v/v) hiện màu vàng nhạt với vanilin/H2SO4 1%
3.1.6. Xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập đƣợc.
3.1.6.1. Xác đinh cấu trúc phân tử của ZRH4
ZRH4 là chất rắn vơ định hình và kết tinh lại trong n-hexan thu đƣợc những tinh thể hình kim, màu trắng, nóng chảy 135-136 oC, có Rf = 0,70 với hệ dung môi n-hexan/EtOAc, 8/2 (v/v). Điểm chảy này trùng với điểm chảy của β-sitosterol chuẩn. Thử điểm chảy hỗn hợp ZRH4 và β-sitosterol tỉ lệ 1:1, điểm chảy không thay đổi. SKLM ZRH4 với β-sitosterol chuẩn trên cùng một bản mỏng và cùng một điều kiện sắc ký, kết quả cho thấy ZRH4 và chất chuẩn có Rf cũng nhƣ màu sắc phổ với thuốc hiện vanilin/H2SO4 1% giống hệt nhau.
Các dữ kiện thực nghiệm này cho thấy ZRH4 là β-sitosterol công thức cấu tạo hình 3.1.
Cặn E (1g)
E1 E2 E3 E4 E5
ZRE2.2 (0.088g)
Phân lập trên cột với hệ rửa giải EtOAc:CHCl3 8:2(v/v)
Tinh chế trên cột nhỏ với hệ dung môi n-hexan: EtOAc, 9:1(v/v)
49 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Hình 3.1
β-sitosterol là hợp chất rất phổ biến trong thực vật, nó đóng vai trị quan trọng trong quá trình sinh trƣởng của thực vật.
3.1.6.2. Xác định cấu trúc phân tử của ZR5.
Phổ IR của ZR5 cho thấy nhóm OH (νOH 3409 cm-1), nhóm este (νC=O 1737 cm-1, νC-O-C 1161 cm-1) và liên kết đơi hai nhóm thế dạng Z (νC=C 1558 cm-1 và δC-H 731 cm-1) (xem phụ lục 1). Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy có 35 nguyên tử cacbon trong phân tử, trong đó có 2 nhóm metyl (CH3): ở 14,06 và 14,23 ppm, 16 nhóm metylen (CH2) trong vùng 20,52 ÷ 36,13 ppm, 12 nhóm metin (CH) trong vùng 127,10 ÷ 131,95, 2 nhóm cacbonyl ở 176,32ppm (xem phụ lục 4 và 5). Đáng chú ý là vùng 60 † 72 ppm, theo Vlahov G. là vùng phổ của 13C chuẩn của cacbon glycerol bị acyl hóa ở các mức độ khác nhau [16] có 3 pic: δC1 = 65,26 ppm là cacbon của nhóm metylen cacbinol bị acyl hóa (C1); δC2 = 70,36 ppm là cacbon của nhóm metin cacbinol bị acyl hóa (C2) và δC3 = 63,35 là cacbon của nhóm metylen cacbinol khơng bị acyl hóa (C3). Rõ ràng độ chuyển dịch hóa học của cacbon của nhóm CH2OH bị acyl hóa nên chuyển dịch về phía trƣờng thấp (xem phụ lục 5).
Phổ khối của ZR5 có M+
= 556 đv (xem phụ lục 2). Từ các số liệu trên cho phép tìm ra cơng thức phân tử ZR5 là C35H56O5 và đây là một glycerol bị acyl hóa ở
50
vị trí 1 và 2, bởi 2 axit có tổng số nguyên tử cacbon là 32 trong đó có 6 liên kết đơi (12CH).
So sánh phổ 1H của ZR5 với phổ 1H của axit (Z,Z,Z)-7,10,13- hexaundecatrienoic [16] và tham khảo phổ 1H-NMR của metyl-9,12,15- octadecatrienoat [17],[18] (xem phụ lục số 3.3) về số nhóm píc , đặc điểm của các nhóm píc cũng nhƣ độ chuyển dịch hóa học của mỗi nhóm chúng tơi có thể khẳng định 2 gốc acyl của hợp chất ZR5 là 2 gốc (Z,Z,Z)-7,10,13-hexadecatrienoyl và công thức cấu tạo của ZR5 đƣợc chỉ ra trên hình 3.2.
Hình 3.2
Phổ 1
H&13C-NMR của ZR5 nhƣ sau:
1/Số liệu 1H &13C-NMR của glycerol bị acyl hóa 1 và 2 trong đó: - Nhóm CH2O- có δC=65,26 ppm; δH = 4,17 ppm (2H, dd, J=6,1) - Nhóm HCO- có δC = 70,36 ppm; δH = 4,19 ppm (1H, m)
- Nhóm CH2OH có δC=63,35 ppm, δH= 3,92 ppm (2H, dd, J1=5,2, J2=6,2) 2/ Số liệu chi tiết phổ 1H&13C-NMR của ZR5 đƣợc cho trên bảng 3.6 và bảng 3.7.
Bảng 3.6. Số liệu 1H-NMR của ZR5 Nhóm b c d e f g h Số H vị trí C CH2 2 CH2 3 2(CH2) 4,5 2(CH2) 6,15 3(CH=CH) 7(8), 10(11), 13(14) 2(CH2) 9,12 CH3 16 δH A1 3,3 4 1,62 1,26 2,05 5,38; 5,44; 5,37; 5,37; 5,43; 5,33 2,78 0,88 A2 3,3 4 1,62 1,26 2,05 5,38; 5,44; 5,37; 5,37; 5,43 2,67 0,97 (A1) (A2)
51 Độ bội A1 t m dd, dd, dd, dd, dd, dd dd t A2 t m dd, dd, dd, dd, dd, dd, dd t J, Hz A1 7,5 6,1; 5,7; 5,9; 5,4; 6,4 6,2; 7,5 7,5 A2 7,5 6,1; 5,7; 5,9; 5,4; 6,4 6,0; 6,2 8,0 Bảng 3.7. Số liệu 13
C-NMR của 2 gốc axit của ZR5
Vị trí C CO C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 A1 176,3 25,5 22,5 29,1 29,1 29,3 129,9 127,1 31,5 129,6 128,0 29,6 127,8 130,0 24,5 14,4 A2 176,3 25,6 22,6 29,1 29,5 29,5 130,0 127,6 31,8 129,7 128,2 29,7 128,0 131,0 24,8 14,6
Nhƣ vậy ZR5 có tên hóa học là 7Z,7‟Z;10Z,10‟Z;13Z,13‟Z-3-hydroxypropan- 1,2-diyldihexadeca-7,10,13-trienoat, hay 1,2-di- (Z,Z,Z)-hexadeca-7,10,13-trienoyl glycerol. Axit (Z,Z,Z)-hexadeca-7,10,13-trienoic là các dẫn xuất thƣờng gặp trong lá, quả và đặc biệt trong hạt của nhiều loại thực vật, nhƣng trong thân rễ thƣờng ít gặp, có lẽ đây là một trƣờng hợp đặc biệt.
3.1.6.3. Xác định cấu trúc của ZRE2.2
Điểm nóng chảy của ZRE2.2 là 66-67 oC trùng với nhiệt độ nóng chảy của Zerunbone chuẩn. Nhiệt độ nóng chảy này khơng thay đổi, khi thử hỗn hợp ZRE2.2 với Zerumbone chuẩn theo tỷ lệ 1:1. Hơn nữa khi tiến hành SKLM ZRE2.2 với Zerumbone chuẩn trên cùng một bản mỏng trong cùng một điều kiện sắc ký và thuốc hiện vanilin/H2SO4 2% cho thấy ZRE2.2 và Zerumbone chuẩn có cùng Rf và sắc đồ cả khi để nguội và hơ nóng.
52
Phổ IR của ZRE2.2 có nhóm cacbonyl (νCO 1723 cm-1), có liên kết đơi 2 nhóm thế dạng E (νC=C 1654 cm-1 và δCH 967 cm-1), liên kết đơi 3 nhóm thế (νC=C 1650 cm-1 và δC-H 830 cm-1) (xem phụ lục số 8).
Phổ MS của ZRE2.2 ghi trên máy Agilent 6310 Ion Trap cho pic [M+1]+
= 219 đv (xem phụ lục số 9).
Phổ 13C và DEPT cho thấy ZRE2.2 có 15 cacbon trong đó có 4CH, 3CH2, 4 CH3, và 4 cacbon bậc 4 ( xem phụ lục số 11 và 12).
Các số liệu trên cho thấy ZRE.2.2 là Zerumbone với cơng thức cấu tạo chỉ ra trên hình 3.3.
Hình 3.3.
Số liệu 1H&13C-NMR của ZRE2.2 chỉ ra chi tiết trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Số liệu phổ 1
H&13C-NMR của ZRE2.2
13C-NMR 1H-NMR Vị
trí C
δC, ppm δH, ppm Số H Độ bội J, Hz ZRE2.2 Tài liệu
[12] C1 42,42 42.44 2,45; 1,90 2H dd 11,3; 12,7 C2 126,9 126.90 5,25 1H dd 5,3; 5,2 C3 127,16 126.46 C4 39,44 39.23 2,36 2H t 12,5 C5 29,42 24.26 2,22 2H q 12,0 C6 137,95 149.97 6,61 1H dd 13,3; 11,0
53 C7 136,36 137.75 C8 206,30 205.53 C9 148,75 126.93 5,97 1H d 16,4 C10 160,69 161.94 5,87 1H d 16,4 C11 37,65 37.63 C12 15,19 14.22 1,54 3H s C13 11,76 10.72 1,79 3H s C14 26,38 23.36 1,07 3H s C15 26,18 28.66 1,20 3H s
Zerumbone phổ biến trong một số loài thực vật họ Gừng nhƣ Curcuma Zedoaria [6], đặc biệt các loài thuộc chi Gừng (Zingiber) nhƣ Gừng tía (Zingiber perpureum), Gừng Gió (Zingiber zerumbet) [8]. Do vậy việc có mặt Zerumbone
trong thân rễ Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum) có thể chấp nhận đƣợc. Và nhƣ thế chúng tôi là ngƣời đầu tiên phát hiện zerumbone trong cây gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.), phát hiện thêm một nguồn nguyên liệu mới cho Zerumbone.
3.2 NGHIÊN CỨU CÂY GỪNG ZINGIBER SP.
3.2.1. Chiết chọn lọc các hợp chất trong thân rễ cây gừng Zingiber sp.
Qui trình chiết các chất thân rễ cây Gừng Zingiber sp. đƣợc thể hiện trong sơ đồ 3.5 và kết quả thể hiện trong bảng 3.9
54
Sơ đồ 3.5. Qui trình điều chế các cặn chiết từ thân rễ cây gừng Zingiber sp.
Thân rễ khô Gừng Zingiber sp. (370g)
1. Ngâm chiết 3 lần với ethanol 96o
ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 3 ngày 2. Lọc bằng phễu lọc Buchner, gộp dịch lọc
3. Cất loại ethanol đến khi dịch cịn 0.5 lít, pha lỗng dịch chiết với 0.2 lít nƣớc muối 10%
Dịch ethanol- nƣớc
Chiết bằng n-hexan
Dịch n-hexan
1. Làm khô 2. Loại dung môi
Dịch ethanol- nƣớc Chiết bằng Cloroform Cặn chiết n-hexan (H) 8 (g) 2.162% Dịch chiết cloroform 1. Làm khô 2. Loại dung môi
Cặn chiết Cloroform (C) 7.1(g) 1.918%
Chiết bằng Etylaxetat
1. Làm khô
2. Loại bỏ dung môi
Dịch chiết Etylaxetat Dich ethanol-
nƣớc
Dịch chiết Etylaxetat (E) 0.6(g) 0.162%
55
Bảng 3.9. Hiệu suất của các chiết thu đƣợc từ thân rễ cây Gừng Zingiber sp.
Cặn chiết n- hexan Cloroform Ethylaxetat
Hiệu suất (%) 2.162 1.918 0.162
Kết quả trên cho thấy các hợp chất chiết đƣợc trong thân rễ cây Gừng Zingiber
sp. chủ yếu là các chất ít phân cực tan trong n-hexan (cặn H). Sau đó là các hợp chất
có độ phân cực mạnh hơn tan trong cloroforom (cặn C) và các hợp chất tan trong dung môi phân cực mạnh ethylaxetat (E) là thấp nhất. Kết quả này cũng phù hợp với tỷ lệ các cặn chiết trong thân rễ tƣơi của cây Gừng lông hung.
3.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các cặn chiết thu đƣợc
Phép thử định tính sinh học (Bioassay guioded test) là phƣơng pháp tốt nhất để tìm kiếm các chất sinh học trong thực vật. Vì vậy chúng tôi sử dụng phƣơng pháp này để thăm dị các chất có hoạt tính sinh học trong cặn chiết từ thân rễ cây Gừng Zingiber sp.
Các cặn chiết H, C và E đã đƣợc thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại phịng sinh học thực nghiệm, Viện Hố học các hợp chất thiên nhiên đối với 8 loại vi sinh vật kiểm định đại diện cho 4 nhóm: 2 khuẩn Gram (-), 2 khuẩn Gram (+), 2 chủng nấm mốc và 2 chủng nấm men. kết quả chỉ ra trên bảng 3.10.