Bảng 1 .1 Các loại Gừng Việt Nam
Bảng 1.10 Thành phần hoá học cặn chiết n-hexan cây Gừng dại tỉnh Kon Tum
Kon Tum STT Tên chất Hàm lƣợng (%) 1 Trans-sabinen hidrat 0,91 2 Terpinen-4-ol 19,58 3 -terpineol 0,63 4 -terpinenyl acetat 1,07 5 -zingiberen 0,79 6 -sesquiphelladren 5,11 Các chất chƣa xác định 53,25
Một số hợp chất phân lập từ cây Gừng tía (Z. montanum Koenig)
Hợp chất đƣợc phân lập từ cặn n- hexan có cấu trúc nhƣ sau: [4] , 2‟,4‟,5‟ - trimethoxyphenbutadien
Đây là chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ cây Alpinia flabellat. sau đó, chất này đƣợc phân lập từ cây gừng tía là chất có hoạt tính kháng cơn trùng mạnh.
Năm 1991 theo các nhà khoa học ngƣời Nhật Bản Ozaki Y, Kawahara M đã phân lập đƣợc 3 hợp chất: (E)-1-(3‟,4‟-dimethoxyphenyl)but-1-ene, (E)-1-(3‟,4‟- dimethoxyphenyl)butadiene and zerumbone từ cặn chiết n-hexan của cây Gừng tía (Zingiber cacssumunar Roxb.).
25
b) Ứng dụng
Thân rễ Gừng tía đƣợc sử dụng làm gia vị thay thế gừng (Z.officinalis) trong chế biến thực phẩm. Gừng tía đƣợc coi là cây thuốc và đƣợc sử dụng trong y học dân tộc tại khắp các nƣớc nhiệt đới châu Á. Tại nhiều nƣớc Đông Nam Á, ngƣời ta sử dụng thân rễ Gừng tía làm thuốc chữa bệnh tiêu chảy, bệnh tả, kiết lỵ, làm thuốc kích thích tiêu hố, thuốc chữa đau dạ dày. Theo Đỗ Tất Lợi (1995), ở nƣớc ta mới chỉ thấy ngƣời dân tộc Bana dùng thân cây để chữa lỵ mãn tính và chữa
26
bệnh toi gà. Ở Lào, Gừng tía đƣợc coi là thuốc chữa ung nhọt, nóng sốt, đau bụng, thuốc lọc máu chống nơn, giải độc và một số bệnh dối loạn đƣờng ruột. Theo một số tài liệu của Thái Lan, thân rễ Gừng tía sử dụng làm thuốc ho, chữa đau cơ bắp và điều trị các vết thƣơng [10]…
1.2. KHÁI QUÁT VỀ CÂY GỪNG LÔNG HUNG (ZINGIBER RUFOPILOSUM GAGN.). GAGN.).
1.2.1. Xuất xứ.
Cây Gừng lông hung đƣợc phát hiện lần đầu tiên tại miền Bắc Việt Nam vào năm 1903 bởi nhà thực vật học nổi tiếng Gagnep. Ông đã phân loại và đặt cho nó tên là Zingiber rufopilosum Gagn. và cơng bố trong tạp chí Bull. Soc. Bot. Fr. 1903; 49; 249. Nó là một trong 12 loại gừng (gingiber) có ở Việt nam (www getamaszet.com./secoinbio) và là một trong khoảng 150 loại gừng có trong khắp tồn cầu (wikimedia 2011).
Gừng lông hung (Z.rufopilosum Gagn.), thuộc chi Gừng (Zingiber), họ
Gừng (Zingiberaceae) là loài cây đặc hiệu của Việt Nam và đã đƣợc ghi vào danh mục nguồn gen cây trồng quí hiếm cần đƣợc bảo tồn ban hành theo quyết định số 80/2005/QĐ-BNN ngày 05 tháng 12 năm 2005 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn.
1.2.2. Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo, cao 1-1,3 m; thân rễ bò. Lá rất sát nhau; phiến lá dạng dải, cỡ 15-20 x 2-3 cm, có lơng hung đỏ ở mép phiến lá, bẹ có sọc, nhiều lơng hung sát vào nhau. Cụm hoa ở ngọn thân có lá, hình nón, cỡ 5-6 x 2,5-3 cm, đầu nhọn. Các lá bắc gần tròn, lợp dày lên nhau, những cái phía dƣới rộng hơn, đƣờng kính tới 2 cm, có lơng ở gốc và ở mép, những chỗ khác nhẵn. Phần dƣới đài dạng ống; phần trên mở rộng ra thành dạng mo, phía đầu cụt, khơng răng. Tràng màu vàng, có phần dƣới dạng ống; phần trên chia thành 3 thùy, các thùy bằng nhau. Bao phấn 2 ô, dài hơn phần phụ trung đới kéo dài. Cánh mơi hình bầu dục dài, đầu xẻ 2, có vân màu nâu, dài hơn nhị lép 2 lần; nhị lép (hay thùy bên của cánh mơi) hẹp, gần nhƣ hình dải,
27
gắn sát gốc cánh mơi. Bầu nhẵn. Vịi nhụy lép hình dùi. Quả nang, vỏ mỏng, hạt 1- 4, hình gần trịn, đƣợc bao bằng áo hạt; áo hạt chia thùy. [7]
1.2.3. phân bố và ứng dụng
Cho đến nay ngƣời ta đã nuôi trồng cây Gừng lông hung (Zingiber
rufopilosum Gagn.) ở miền Bắc Việt nam mà chủ yếu là các tỉnh ở Phú Thọ (Xuân
Sơn), Tuyên Quang (Na Hang), Hồ Bình (Mai Châu), Hà Nội (Ba Vì).
Nhân dân trồng Gừng lông hung để làm thuốc và dân gian sử dụng củ (thân rễ) cây Gừng lông hung để chữa các bệnh về đƣờng ruột nhƣ đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy, cảm cúm và ngâm rƣợu xoa bóp khi đau nhức các khớp xƣơng.
Hình 1.1. Thân rễ Gừng Lơng Hung (Zingiber rufopilosum Gagn.)
28
1.2.4. Các nghiên cứu hoá học và hoạt chất sinh học của cây gừng lông hung (Z.
rufopilosum Gagn.)
Nhƣ trên đã trình bày Gừng lơng hung là cây đặc hữu của Việt nam chƣa tìm thấy ở các nƣớc khác trên thế giới, đó có thể là lí do cho sự thiếu vắng các nghiên cứu về cây này công bố trên các tạp chí thế giới.
Mặc dù đƣợc phát hiện từ năm 1903 nhƣng Gừng lông hung vẫn là cây q hiếm rất khó tìm kiếm và thu mua, đó có thể là lí do cho đến nay hầu nhƣ chƣa có cơng trình khoa học nào công bố về kết quả nghiên cứu của cây Gừng lơng hung trên các tạp trí trong nƣớc.
1.3. KHÁI QUÁT VỀ CÂY GỪNG ZINGIBER SP.
Đây là loài cây mọc phổ biến ở các huyện phía tây của tỉnh Lâm Đồng. Nhân dân địa phƣơng gọi cây này là Gừng gió. Nhƣng về hình thái: Củ, lá, hoa và quả không giống nhƣ củ, lá, hoa và quả cây Gừng gió (Zingiber zerumbet (L.) J.E. Sm) nên chúng tơi gọi nó là Zingiber sp. Xem hình 1.2.
29
CHƢƠNG 2- ĐỀ TÀI, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỀ TÀI
Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong một số lồi cây thuộc chi gừng (Zingiber).
2.1.1. Xuất sứ và tiêu chí lựa chọn đề tài
Khí hậu nƣớc ta nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, thảm thực vật phong phú và đa dạng, cây thuốc có tới khoảng 3948 lồi. Trong các cây thuốc dân tộc thì những lồi thuộc họ gừng đóng một vị trí quan trọng trong ngành y dƣợc. Hai trong số những loài thuộc chi gừng đó là: Gừng lơng hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và cây Gừng Zingiber Sp., đã đƣợc dân gian sử dụng nhƣng hiện nay vẫn chƣa có cơng trình khoa học nào cơng bố kết quả nghiên cứu về hai lồi này.
Nhƣ phần tổng quan đã trình bày Gừng lơng hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) là cây thuốc dân tộc nổi tiếng từ lâu đời. Nhân dân dùng thân rễ cây Gừng lông hung ngâm rƣợu để xoa bóp các khớp xƣơng khi bị sƣng đau, nhức mỏi do thay đổi thời tiết hay sắc để uống khi đau bụng khó tiêu, đầy hơi hay tiêu chảy.
Gừng lông hung là cây đặc hữu của Việt Nam thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) đã đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn xếp vào loại cây trồng quý hiếm cần đƣợc bảo tồn nguồn gen theo quyết định số 08/2005/QĐ-BNN, ký ngày 05/12/2005. Cây Gừng lông hung thuộc các nguồn gen trao đổi quốc tế trong trƣờng hợp đặc biệt.
Từ những lí do trên chúng tôi chọn cây Gừng lông hung và cây Gừng
Zingiber sp. làm đối tƣợng nghiên cứu và chọn tên đề tài “Nghiên cứu các hợp chất
có hoạt tính sinh học trong một số lồi thuộc chi Gừng (zingiber)‟‟: Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và Gừng Zingiber sp.
30
2.1.2. Mục tiêu của đề tài
Xây dựng quy trình chiết chọn lọc các chất trong thân rễ cây Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và cây Gừng Zingiber sp.
Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các cặn chiết thu đƣợc Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết đƣợc
Xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập đƣợc bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Dụng cụ và hoá chất
Các dung môi hữu cơ sử dụng: Hexane, chlorofome, etylaxetat, acetone, methanol và ethanol.
Dung môi hữu cơ để chiết mẫu thực vật, khảo sát sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột phải là dung môi tinh khiết (PA). Nếu dung mơi cơng nghiệp thì phải sử lý nhƣ sau: Dung môi etylaxetat kỹ thuật đƣợc rửa axit 3 lần với dung dich Na2CO3 5%, sau đó đƣợc rửa bằng nƣớc cất đến pH=7. Làm khơ bằng Na2SO4 khan sau đó bằng CaCl2 khan, cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 76-780C.
Dung môi n-hecxane kỹ thuật đƣợc rửa bằng axit H2SO4 đậm đặc, sau đó đƣợc rửa bằng nƣớc cất đến pH=7, làm khô bằng Na2SO4 khan và cất lấy ở phân đoạn có nhiệt độ 67-680C.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc chạy trên những bản nhôm tráng sẵn silicagel 60F254 độ dày 0,2mm của hãng Merck.
Các sắc đồ lớp mỏng đƣợc nhận bằng:
Thuốc thử Vanilin/H2SO4 1% (dùng để nhận biết các nhóm chức nhƣ steroit, tecpenoit, saponin, các chất màu, chất sáp…), đƣợc điều chế nhƣ sau: cho 0,2g vanilin vào 10ml H2SO4 đặc 98% khuấy đến khi tan hết, thu đƣợc dung dịch thuốc thử.
Thuốc thử Dragendorff để nhận biết các ankaloit, đƣợc điều chế nhƣ sau: Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hoà tan trong 40ml nƣớc cất và 10 ml axit
31
axetic băng. Dung dịch 2: Lấy 8 gam KI hoà tan trong 20ml nƣớc cất. Lấy 2ml dung dịch 1 trộn với 5ml dung dịch 2 và thêm 20ml axit axetic sau đó thêm nƣớc đến 100ml là đƣợc thuốc thử Dragendorff.
Thuốc thử FeCl3 để nhận biết các hợp chất flavonoid, các axit cacboxylic. Chất hấp thụ dùng trong q trình sắc kí cột là silicagel cỡ hạt 0.040-0.063mm của hãng Merck. Sắc kí cột sử dụng 3 loại cột có kích thƣớc khác nhau : Cột 1: Ø= 4cm; l= 100cm Cột 2: Ø= 2.5cm; l=60cm Cột 3: Ø= 1.5 cm; l=40 cm
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Máy xác định điểm chảy Boetius
Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Impac 410-Nicolet FT-IR
Phổ khối lƣợng ESI-MS, APCI-MS Ion Trap Agilent 1200 Series (USA). Máy sắc kí khí nối ghép khối phổ GC-MS Agilent 6890N
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR): 1
H-NMR, 13C-NMR, 13C-NMR-DEP- 135, 13C-NMR-DEP-90, HMBC, HSQC đƣợc ghi trên máy Brucker Advance- 500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hoá học (δ) đƣợc biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.
2.3. THỰC NGHIỆM
2.3.1 Mẫu thực vật
Nguyên liệu thực vật là thân rễ cây Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) thu thập vào tháng 4 năm 2011 tại Vĩnh Phúc và thân rễ cây gừng Zingiber
sp. thu thập vào tháng 10 năm 2011 tại Lâm Đồng do TS. Nguyễn Quốc Bình,
phịng Sinh vật - Viện Bảo tàng Thiên nhiên Việt nam thuộc Viện khoa học và Công nghệ Việt nam giám định và phân loại.
32
Xử lý nguyên liệu: Thân rễ Gừng lông hung và Gừng Zingiber sp. đƣợc rửa
sạch loại bỏ phần hƣ hỏng, thái lát mỏng từ 2- 3 mm sau đó đƣợc nghiền nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh để phục vụ cho nghiên cứu.
2.3.2.Chiết các hợp chất từ thân rễ cây gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.).
Cân 4,2 kg thân rễ tƣơi cây Gừng lông hung, rửa sạch loại bỏ phần hƣ hỏng, xay nhỏ ngâm trong 5 lít ethanol 960 trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Lọc bằng phễu lọc Buchner lấy dịch và ngâm tiếp 2 lần nữa mỗi lần 5 lít ethanol 960, gộp dịch chiết lại sau đó loại bỏ bớt ethanol bằng cách đun cách thuỷ đến khi dịch cịn khoảng 3lít. Thêm nƣớc vào đến khi dịch chiết còn 20% ethanol, thêm 2 kg muối, chiết 3 lần bằng dung môi n-hecxane, mỗi lần 300ml.
Dịch chiết nƣớc cồn còn lại chiết tiếp 2 lần bằng cloroform, lần 1 chiết 300ml, lần 2 là 200ml.
Dịch chiết nƣớc cồn sau khi chiết bằng cloroform chiết tiếp bằng etyl axetat. Do etyl axetat tan một phần trong dịch chiết nên lƣợng dung môi sử dụng phải lớn mới tách lớp và thêm muối để khả năng tách lớp tốt hơn. tiến hành chiết 3 lần: lần 1là 1000ml, lần 2 là 300ml và lần 3 là 200ml.
Làm khô các dịch chiết bằng Na2SO4, cất loại hết dung môi và thu các cặn chiết tƣơng ứng chỉ ra trong bảng 3.1 (chƣơng 3, kết quả và thảo luận).
2.3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết thu đƣợc. đƣợc.
Hoạt tính vi sinh vật kiểm định đƣợc tiến hành đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết đƣợc thực hiện trên các phiến vi lƣợng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phƣơng pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và McKane, L., & Kandel (1996).
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC25923)
33
Staphylococcus aureus (ATCC12222)
Nấm sợi: Aspergillus niger (439) Fusarium oxysporum (M42)
Nấm men: Candida albicans (ATCC 1154) Saccharomyces cerevisiae (SH 20)
Chứng dƣơng tính:
Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)
Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men.
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM.
Chứng âm tính:
Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử
Môi trƣờng cấy vi sinh vật:
Mơi trƣờng duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)- Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trƣờng Trypcase Soya Broth (TSB)- Sigma.
Môi trƣờng thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Tiến hành thí nghiệm:
Các chủng kiểm định đƣợc hoạt hố và pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 370C/24 giờ cho vi khuẩn và 300C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Kết quả dƣơng tính là nồng độ mà ở đó khơng có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trƣờng thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU<5.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính:
34
Các chất có hoạt tính đƣợc sàng lọc ban đầu đƣợc pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5-10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần nhƣ hoàn tồn.
Mẫu thơ có MIC ≤ 200μg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50μg/ml/ml là có hoạt tính.
Kết quả thu đƣợc: Mẫu cặn chiết Cloroform biểu hiện hoạt tính kháng 2 nấm men
S.cereviseae và C.albicans ( xem bảng 3.2, chƣơng 3, kết quả và thảo luận).
2.3.2.2. Sắc kí lớp mỏng khảo sát cặn chiết của thân rễ cây gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.). (Zingiber rufopilosum Gagn.).
Cho chất lên bản sắc kí: Hồ tan hồn tồn cặn chiết bằng dung môi chiết sao
cho dịch thu đƣợc khơng q lỗng hay quá đặc. Dùng capila thuỷ tinh lấy chất chấm lên bản mỏng sao cho vệt chấm phải tròn, nhỏ, gọn và cách mép bên của bản mỏng 0,5cm; cách chân bản mỏng 0,7cm. Vệt nọ cách vệt kia 0,5cm. Chiều dài bản mỏng 6,5cm.
Tiến hành SKLM: Pha hệ dung môi với tỉ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí nút
nhám và lắc kĩ để các dung mơi hồ tan vào nhau. lƣợng dung mơi lấy sao cho sau khi triển khai SKLM không để dung môi ngập vết chất.
Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng đƣợc đặt nghiêng một góc 150. Bình sắc kí phải đứng yên trong quá trình triển khai sắc kí. Khi tuyến dung môi chạy các mép trên của bản mỏng 0,3cm thì lấy bản mỏng ra, làm khơ bản mỏng và sau đó hiện sắc phổ bằng vanllin/H2SO4 , Dragendorff và FeCl3 1% (pH=3).
a) Sắc kí lớp mỏng khảo sát cặn chiết H: Tiến hành khảo sát cặn chiết H và tìm ra hệ dung mơi tối ƣu là n-hexan: etylaxetat tỉ lệ 8:2 (v/v), phát hiện vết chất trên lớp bản mỏng bằng phun thuốc thử vanillin/H2SO4 1%, Dragendorff, FeCl3 1% . kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.3 (Chƣơng 3, kết quả và thảo luận).
b) Sắc kí bản mỏng khảo sát cặn C: Hệ dung môi tối ƣu Cloroform: Acetone tỉ lệ 8:2 (v:v) phát hiện vệt chất trên bản mỏng bằng phun thuốc thử
35
vanillin/H2SO4 1%, Dragendorff, FeCl3 1% kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4 (chƣơng 3, kết quả và thảo luận).
c) Sắc kí bản mỏng khảo sát cặn E: Hệ dung mơi sắc kí tối ƣu etylaxetat:
cloroform tỉ lệ 8:2 (v:v) phát hiện vệt chất trên bản mỏng bằng phun thuốc thử vanillin/H2SO4 1%, Dragendorff và FeCl3 1% kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.5 (chƣơng 3, kết quả và thảo luận).
2.3.2.3.Phân lập các chất có trong các cặn chiết H, C và E a) Phân lập các chất trong cặn H. a) Phân lập các chất trong cặn H.
+ Chuẩn bị cột sắc kí: Cột đƣợc dùng có khố kín ở dƣới, dài 100cm,
đƣờng kính 4cm. Rửa sạch bằng hỗn hợp axit sunfocromic, rửa lại bằng nƣớc cất rồi tráng cồn sấy khơ. Khố cột phải đƣợc tra mỡ silicon để đảm bảo đƣợc xoay chuyển dễ dàng.
+ Nhồi cột theo phƣơng pháp nhồi ƣớt: Cân lƣợng silicagel (cỡ hạt
0.040-0.060 mm của hãng Merck) vừa đủ hồ với dung mơi n-hexan trong cốc thuỷ tinh, khuấy đều đến khi khơng cịn bọt khí trong cốc. Mở khố cột và đổ hỗn hợp