2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: từ ngày 10/2 đến ngày 30/6/2014
Địa điểm: thực hiện tại phịng thí nghiệm hóa hữu cơ thuộc Viện Công nghệ Hóa học, số 1 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh.
STT Tên hóa chất Nơi sản xuất
1 Acid acetic Trung quốc
2 NaCl Trung quốc
3 NaOH Trung quốc
4 Cồn Trung quốc
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 27 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết collagen từ da cá tra
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết collagen từ da cá tra bằng acid acetic. a) quá trình loại tạp chất
Mục đích: làm sạch da và loại bỏ các tạp chất nhƣ: chất béo, protein hòa tan, các sắc tố,… nhằm nâng cao chất lƣợng collagen và tăng hiệu quả quá trình tách chiết.
Da cá Xử lý sơ bộ Xử lý với NaOH 0,1M Rửa sạch bằng nƣớc Xử lý với ethanol >90% Rửa sạch bằng nƣớc Xử lý với dung môi cao su
Rửa sạch bằng nƣớc Cắt nhỏ Trích ly Lọc Kết tủa Thẩm tích Đơng khơ Collagen thành phẩm Nƣớc Tạp chất Nƣớc Nƣớc Tạp chất Tạp chất CH3COOH 0,7M
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 28 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Tiến hành:
Da cá đƣợc xử lý sơ bộ bằng phƣơng pháp cơ học nhƣ loại bỏ các phần thịt mỡ cịn sót lại, rửa sạch bằng nƣớc.
Sau đó da cá đƣợc xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch NaOH 0,1M trong 24 giờ ở nhiệt độ 40C, tiến hành thay dung dịch 5 lần. Sau mỗi lần thay dung dịch NaOH cần rửa nhiều lần với nƣớc sạch.
Sau khi xử lý da cá với NaOH tiếp tục xử lý với dung dịch cồn (>90%) trong 8 giờ ở nhiệt độ 40C, tiến hành thay dung dịch 3 lần và rửa với nƣớc sạch sau mỗi lần thay dung dịch.
Cuối cùng da cá đƣợc xử lý bằng dung môi cao su trong 48 giờ ở 40
C và rửa lại thật sạch với nƣớc.
Hình 2.2. Da cá sau khi xử lý. b) Q trình tách chiết
Xoay nhuyễn
Mục đích: nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa da cá và dung môi dùng để tách chiết, tăng hiệu suất tách chiết.
Tiến hành: da cá sau khi đƣợc ngâm trong acid acetic 24h đem xay nhuyễn bằng máy xay.
Trích ly
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 29 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Tiến hành: da cá sau khi đã làm sạch tạp chất đƣợc ngâm trong dung dịch acid acetic 0,7M trong 72 giờ ở 40C với tỷ lệ khối lƣợng da và dung mơi là 1:30 (g/ml).
Hình 2.3. Da cá ngâm sau 72 giờ.
Quá trình tách chiết colagen trong acid acetic ở thời gian 72h, nếu để càng lâu thì collagen sẽ bị phân hủy bởi acid, do đó hiệu suất thu collagen của ta sẽ thấp.
c) Lọc
Mục đích: tách bã chƣa thủy phân hết để thu dung dịch collagen thô.
Tiến hành: dung dịch collagen thô đƣợc lọc 2 lần bằng gạc 4 lớp để loại bã tốt hơn.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 30 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
d) Kết tủa
Mục đích: tách collagen ra khỏi dung môi acid acetic.
Tiến hành: dung dịch collagen thô đƣợc tủa bằng dung dịch NaCl bão hòa với tỷ lệ 1:3 (ml/ml).
Hình 2.5. Kết tủa collagen bằng dung dịch NaCl bão hịa. e) Thẩm tích
Mục đích: tiến hành thẩm tích để loại bỏ muối, acid acetic ra khỏi collagen. Tiến hành: tiến hành thẩm tích bằng màng cellophane cho phép những phân tử có kích thƣớc nhỏ hơn 5000 đvC đi ra khỏi màng. Tiến hành thẩm tích trong dung mơi nƣớc cất trong 48 giờ, thay nƣớc 6 lần.
Muối và acid có kích thƣớc phân tử nhỏ sẽ khuếch tán từ dung dịch collagen có nồng độ cao ra ngồi dung mơi nƣớc có nồng độ thấp, cịn collagen có kích thƣớc phân tử lớn sẽ đƣợc giữ lại bên trong. Nƣớc sẽ khuếch tán từ dung mơi có nồng độ cao vào dung dịch collagen có nồng độ thấp, vì vậy khi ta thay nƣớc nhiều lần sẽ giúp q trình thẩm tích hiệu quả hơn.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 31 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Hình 2.6. Quá trình thẩm tích collagen. f) Đơng khơ
Mục đích: loại bỏ nƣớc trong dung dịch collagen để thu đƣợc collagen sạch, có nồng độ cao.
Tiến hành: Dung dịch collagen sạch đƣợc làm lạnh sâu ở -760C để chuyển từ thể lỏng sang thể rắn. Sau đó tiến hành đơng khơ ở -800C trong 12 giờ để chuyển nƣớc từ thể rắn sang thể hơi.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 32 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
2.2.3. Phƣơng pháp thủy phân collagen bằng enzyme protamex kết hợp với sóng siêu âm âm
Đối với quá trình thủy phân các cơ chất có kích thƣớc lớn, trong mơi trƣờng siêu âm, ngoài tác động phân giải của enzyme, các cơ chất cao phân tử còn chịu sự phân cắt bởi sóng siêu âm có cƣờng độ nhất định. Hiệu ứng cơ học từ quá trình sủi bóng, sự vỡ bong bóng đột ngột qua các chu trình nén giãn sẽ tạo nên một gradient áp suất cao cùng với tăng tốc độ chuyển động cục bộ của lớp chất lỏng ở những vùng lân cận. Sự thay đổi tuần tự này có thể tạo nên lực cắt mà khơng có ảnh hƣởng đáng kể trên phân tử nhỏ nhƣng có thể phá vỡ cấu trúc chuỗi polymer. Ngồi ra, các hiêu ứng nhiệt cục bộ và hiệu ứng hóa học (sự phân ly của H2O thành các gốc tự do) diễn ra cũng có thể làm mạch polymer bị đứt gãy. Nhờ vào tác động này mà hiệu quả tiếp xúc của enzyme đến cơ chất có hoặc chƣa bị phân giải đƣợc cải thiện nhiều hơn. Sản phẩm của quá trình phản ứng xúc tác cũng tăng lên nhanh hơn so với khi không sử dụng siêu âm kết quả dẫn đến làm tăng tốc độ phản ứng enzyme xúc tác. Tuy vậy, tác động này là tách biệt hoàn toàn với hoạt động xúc tác và chỉ đóng vai trị hỗ trợ để phản ứng của enzyme diễn ra dễ dàng và thuận lợi hơn.
Thực hiện:
Collagen đƣợc hòa tan với nƣớc cất theo tỷ lệ 4ml nƣớc cất : 1g collagen. Sau đó ta cho enzyme Bromelain vào theo tỉ lệ 100g collagen : 1g enzyme và tiến hành đánh siêu âm ở 450C trong 60 phút. Tiến hành 4 lần mỗi lần 15 phút.
Kết quả dung dịch trở nên trong vẫn còn phần đục nâu, ly tâm lấy dịch trong collagen.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 33 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Hình 2.8. Thiết bị thủy phân collagen thơ bằng sóng siêu âm.
Hình 2.9. Dung dịch collagen thơ.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 34 Khoa Hóa học và công nghệ thực phẩm
2.2.4. Phƣơng pháp pha trộn collagen vào kem dƣỡng ẩm a. Độ hòa tan của kem và nƣớc a. Độ hòa tan của kem và nƣớc
Để xác định kem và nƣớc có hịa tan khơng và ta có thể hịa đƣợc bao nhiêu % nƣớc vào kem dƣỡng ẩm ban đầu mà vẫn giữ đƣợc dạng nhũ đồng nhất của kem (không bị tách lớp).
Chuẩn bị 3 mẫu mỗi mẫu 1g kem, cho nƣớc với hàm lƣợng 10%, 20%, 30% vào 3 mẫu kem, khuấy trộn thật đều, để ổn định sau vài ngày. Ta thấy ở hàm lƣợng 30% kem vẫn giữ đƣợc dạng nhũ đồng nhất.
b. Độ hòa tan của collagen và nƣớc
Để xác định collagen có tan trong nƣớc khơng và cần bao nhiêu nƣớc tối thiểu để hịa tan hồn tồn collagen.
Cân 0,1g collagen, cho nƣớc từ từ vào theo tỷ lệ 2:1, 1:1, 1:2…(collagen (g) : nƣớc (ml)), khuấy đều đến khi collagen tan hết. Ta thấy ở tỷ lệ 1:1 collagen đã tan hoàn toàn.
c. Độ hòa tan của collagen và kem
Để xác định collagen có tan trong kem khơng và có thể hịa đƣợc bao nhiêu % collagen vào kem mà collagen tan hết và kem vẫn giữ đƣợc dạng nhũ đồng nhất (không bị vốn cục, khô).
Cân 0,6g kem, cho từ từ collagen (0,1; 0,2; 0,3; 0,4…g) vào trộn đều đến khi thấy collagen không tan nữa. Ta thấy khi cho đến 0,3g collagen vẫn tan tốt nhƣng đến 0,4g thì khơng tan nữa. Vậy ở tỉ lệ 1:2 (collagen : kem) hay hàm lƣợng 33,33% thì collagen vẫn tan tốt trong kem.
d. Pha trộn collagen vào kem dƣỡng ẩm
Ta pha trộn collagen vào kem dƣỡng ẩm với các hàm lƣợng 5%, 10%, 15%, 20%, 25% theo 2 cách: pha trực tiếp collagen vào kem và pha collagen với nƣớc trƣớc rồi mới pha vào kem.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 35 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Mẫu 1 (5% collagen) : ta tiến hành trộn thật đều 1g collagen với 19g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 2 (10% collagen) : ta tiến hành trộn thật đều 2g collagen với 18g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 3 (15% collagen) : ta tiến hành trộn thật đều 2g collagen với 11,34g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 4 (20% collagen) : ta tiến hành trộn thật đều 2g collagen với 8g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 5 (25% collagen) : ta tiến hành trộn thật đều 2g collagen với 6g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Hình 2.11. Các mẫu collagen pha trực tiếp vào kem (mẫu 1, mẫu 2, mẫu 3, mẫu 4, mẫu 5).
Pha với nƣớc trƣớc
Mẫu 6 (5%+ collagen) : tiến hành pha 1g collagen với 1ml nƣớc, khuấy trộn đến khi collagen tan hoàn toàn rồi trộn đều với 19g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 7 (10%+ collagen) : tiến hành pha 2g collagen với 2ml nƣớc, khuấy trộn đến khi collagen tan hoàn toàn rồi trộn đều với 18g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 36 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Mẫu 8 (15%+ collagen) : tiến hành pha 2g collagen với 2ml nƣớc, khuấy trộn đến khi collagen tan hoàn toàn rồi trộn với 11,34g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 9 (20%+ collagen) : tiến hành pha 2g collagen với 2ml nƣớc, khuấy trộn đến khi collagen tan hoàn toàn rồi trộn với 8g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Mẫu 10 (25%+ collagen) : tiến hành pha 2g collagen với 2ml nƣớc, khuấy trộn đến khi collagen tan hoàn toàn rồi trộn với 6g kem nền đến khi collagen tan hết, mẫu kem thật đồng đều.
Hình 2.12. Các mẫu collagen hòa tan với nƣớc trƣớc rồi pha vào kem (mẫu 6, mẫu 7, mẫu 8, mẫu 9, mẫu 10).
2.2.5. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan đối với kem
Phƣơng pháp đơn giản, nhanh chống đánh giá cảm quan bên ngồi, trạng thái, mùi,… từ đó chọn ra hàm lƣợng collagen phù hợp phối trộn vào kem nền.
a) Độ trong: Đánh giá bằng mắt thƣờng.
Nền đục Nền trong
- 0 ++
b) Độ đồng nhất: sau khi phối trộn xong để ổn định 48h sau đó quan sát bằng mắt thƣờng độ bóng mịn.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 37 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Nền khơng bóng mịn Nền bóng mịn
- 0 ++
c) Khả năng thẩm thấu: thể hiện thời gian thẩm thấu của sản phẩm trên da. Cho 0.1 mẫu vào vùng diện tích đặt ra ( 25cm2), dùng một đầu ngón tay thoa nhẹ trên. Tính thời gian thẩm thấu từ lúc bắt đầu thoa và cho đến khi mẫu trên da đã khô.
25s 35s 45s 50s
++ + 0 _ _ _
d) Độ mƣợt da: Dùng một lƣợng mẫu thoa lên mui bàn tay, sau khi mẫu serum đã thấm và khơ, thì dùng các đầu ngón tay để kiểm tra độ mƣợt trên da.
Da không mƣợt Da mƣợt có thấy lớp
film
- 0 ++
2.2.6. Phƣơng pháp kiểm tra chỉ tiêu kích ứng của kem
Đây là phƣơng pháp xác định đơn giản nhất độ kích ứng của da khi một chất hay một dạng mỹ phẩm nào đó tiếp xúc trực tiếp lên da. Tiến hành qua 4 bƣớc :
Bƣớc 1 : Sử dụng một lƣợng nhỏ bằng hạt đậu trên đầu ngón tay.
Bƣớc 2 : Thoa nhẹ vào những vùng da mỏng nhƣ : vùng da cổ tay bên trong, sau gáy. Vùng da này phải đƣợc rửa sạch trƣớc khi thoa kem lên.
Bƣớc 3: Để yên và không rửa trong khoảng thời gian 48h.
Bƣớc 4 : trong khoảng thời gian từ 0h – 48h theo dõi các dấu hiệu nóng rát, ngứa, châm chít, vùng thoa bị ửng đỏ. Nếu sau 48h khơng thấy bất kỳ dấu hiệu nào thì có thể kết luận sản phẩm khơng gây kích ứng.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 38 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
2.2.7. Phƣơng pháp xác định độ bền của kem
Công thức mỹ phẩm là một dạng hỗn hợp các thành phần có chức năng khác nhau đƣợc phối trộn lại. Do đó để đảm bảo đƣợc tính an tồn và cũng nhƣ tính hiệu quả cao của công thức mỹ phẩm tới tay ngƣời tiêu dùng thì phải thực hiện phƣơng pháp kiểm tra độ ổn định sản phẩm. Phƣơng pháp kiểm tra độ ổn định đảm bảo khơng có bất cứ sự thay đổi nào về tính chất hóa lý trong thời hạn sử dụng. Cho phép xác định sơ bộ hạn sử dụng của một công thức mỹ phẩm.
a. Phƣơng pháp sốc nhiệt
Mục đích: kiểm tra độ bền nhũ khi có sự thay đổi đột ngột về nhiệt. Tiến hành: Mẫu ban đầu ở nhiệt độ phòng đƣợc trữ ở nhiệt độ 45o
C trong 24h và sau 24h mẫu đƣợc chuyển sang nhiệt độ 0 oC và đƣợc tiếp tục lƣu trong 24h. Đây đƣợc gọi là chu kỳ nóng – lạnh. Mẫu đƣợc tiếp tục thực hiện trong 6 chu kỳ.
Đánh giá: Kiểm tra trạng thái bên ngoài của sản phẩm, nếu thấy dấu hiệu nổi bơng hay tách pha thì khơng ổn định.
Kiểm tra chỉ tiêu pH trƣớc và sau khi thực hiện 2 chu kỳ (4 ngày) , và cứ 2 chu kỳ kiểm tra một lần. Độ lệch về chỉ số pH thấp nhất thì mẩu bền ở điều kiện sốc nhiệt.
b. Phƣơng pháp ly tâm
Mục đích: kiểm tra độ bền của nhũ dƣới tác dụng của lực ly tâm. Đây đƣợc xem là phƣơng pháp kiểm tra nhanh nhất độ bền nhũ.
Tiến hành: mẫu ở nhiệt độ thƣờng đƣợc ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/ phút trong 30 phút.
Đánh giá: giống nhƣ phƣơng pháp sốc nhiệt, kiểm tra trạng thái bên ngoài và chỉ tiêu pH sau mỗi lần ly tâm.
2.2.8. Phƣơng pháp đánh giá hoạt tính của kem
Mục đích: đánh giá khả năng giữ ẩm của collagen khi pha vào kem nền ở các nồng độ khác nhau.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 39 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
Tiến hành: lấy 1 ít mẫu thoa vào phí bên trong vùng da cổ tay, đo độ ẩm của da ở những thời điểm: lúc mới thoa, 10 phút sau khi thoa, 15 phút, 20 phút….. đến khi độ ẩm giảm (kem hết tác dụng).
2.3. Các phƣơng pháp phân tích
2.3.1. Phƣơng pháp sắc ký lọc gel
Khối lƣợng phân tử của sản phẩm thủy phân collagen đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel trên máy Agilent GPC - Addon Rev.B01.01 tại Viện Khoa học Vật Liệu ứng dụng, số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP HCM.
2.3.2. Xác định độ pH
Độ pH của dung dịch collagen đƣợc xác định bằng máy đo pH Hanna pH210 tại Viện Công nghệ Hóa học, số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP HCM.
2.3.3. Xác định độ ẩm
Độ ẩm của da đƣợc xác định bằng máy đo độ ẩm Skincore tại Viện Cơng nghệ Hóa học, số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP HCM.
Ngành cơng nghệ kỹ thuật hóa học 40 Khoa Hóa học và cơng nghệ thực phẩm
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận collagen 3.1. Thu nhận collagen
3.1.1. Hiệu suất thu hồi collagen
Bằng phƣơng pháp tách chiết hóa học (sử dụng acid acetic) collagen từ 2 kg da cá tra thu đƣợc 603,8 g collagen (sau khi đơng khơ) sau khi trích ly lần một, chiếm 30,19% (theo trọng lƣợng khơ) và lần trích ly thứ hai cho kết quả không đáng kể. Kết quả này thấp hơn kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Hà “Tách chiết và nghiên cứu tính chất collagen trong da cá Basa” hiệu suất 32,13% và cũng thấp hơn nghiên cứu của Nguyễn Thị Hƣơng Thảo (trung tâm Công nghệ Sau thu hoạch) “Nghiên cứu tách chiết