+ Chuẩn bị:
- Huyết thanh của gà ựược lấy ngẫu nhiên trong ựàn ở các giống, các lứa tuổi khác nhau.
- Cách lấy máu: Dùng bơm tiêm lấy máu tĩnh mạch cánh (0,5 - 1ml), sau ựó bơm từ từ lên thành ống nghiệm, ựể nghiêng 450 ựậy nút ựể yên cho ựông, các mẫu máu mang về phòng thắ nghiệm ựể ở tủ lạnh 40C trong 2h, sau ựó chắt lấy huyết thanh. Có thể ựể nguyên trong bơm tiêm và mang thẳng về phòng thắ nghiệm trong ngày.
- Kháng nguyên chuẩn Mycoplasma gallisepticum do Viện Thú y Hàn
Quốc sản xuất. Kháng ngun phải ựảm bảo ựúng tiêu chuẩn: khơng có hạt hoặc kết tủa, tuyệt ựối vô trùng.
- Kháng thể chuẩn do Viện Thú y Hàn Quốc chế tạo, ựựng trong ống thủy tinh 0,1ml, kháng thể ựược bảo quản ở 60C.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
+ Tiến hành phản ứng
Trước khi làm phản ứng, kháng nguyên và kháng thể phải ựược ựể ở nhiệt ựộ phòng, kháng nguyên phải lắc nhẹ cho ựều.
- Phản ứng chuẩn dương: Giữa kháng nguyên chuẩn và kháng thể chuẩn khi kết hợp với nhau sau 1 - 2 phút xuất hiện ngưng kết ựiển hình hạt ngưng kết màu xanh lấm tấm nổi lên trên, nước xung quanh trong.
- Phản ứng chuẩn âm: giữa kháng nguyên chuẩn với nước sinh lý khơng có hiện tượng ngưng kết và dung dịch vẫn giữ màu như cũ.
- Kỹ thuật xét nghiệm:
Chuẩn bị các phiến kắnh sạch vô trùng.
Dùng bơm tiêm hút 1 giọt kháng nguyên, nhỏ lên phiến kắnh, sau ựó nhỏ tiếp 1 giọt huyết thanh, trộn ựều thành vòng tròn, ựể yên theo dõi và ựọc kết quả.
- đọc kết quả:
- Phản ứng dương tắnh: sau khi trộn kháng nguyên và huyết thanh 1 - 2 phút (hoặc hơn tùy theo hàm lượng kháng thể nhiều hay ắt). Hiện tượng ngưng kết xảy ra tương tự như phản ứng chuẩn dương, kết luận gà mắc bệnh.
- Phản ứng âm tắnh: Sau khi trộn 2 - 5 phút khơng có các hạt ngưng kết, dung dịch giữ màu như cũ, kết luận gà không nhiễm bệnh.
2.3.4.2. Phương pháp xác ựịnh bệnh qua lâm sàng
Có nhiều yếu tố gây ảnh hưởng ựến sự khởi phát của bệnh cũng như triệu chứng lâm sàng như thời tiết thay ựổi, môi trường ô nhiễm, giống gà, lứa tuổi cảm nhiễm,ẦDo ựó khi những yếu tố này xuất hiện, cần phải theo dõi tình trạng sức khỏe của ựàn gà, kịp thời phát hiện những biểu hiện như chảy nước mũi, ho, thở có tiếng ran, giảm sản lượng trứng.
2.3.4.3. Phương pháp xác ựịnh bệnh qua mổ khám bệnh tắch
Thực hiện mổ khám những cá thể có triệu chứng lâm sàng ựiển hình và xét nghiệm huyết thanh học dương tắnh, xác ựịnh bệnh tắch ở các cơ quan tổ chức như: ựường hô hấp trên, phần ựầu, khắ quản, phế quản, phổi, túi khắ,Ầ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
Căn cứ ựể kiểm tra bệnh tắch: Gà có biểu hiện túi khắ ựục, viêm màng phổi, niêm mạc họng, khắ quản xung huyết, xuất huyết, họng có nhiều dịch nhớt.
2.3.4.4. Phân lập vi khuẩn kế phát từ mẫu bệnh phẩm gà mắc CRD
- Nguyên liệu:
Họng, khắ quản, phổi của gà mắc bệnh CRD ựược xác ựịnh bằng phản ứng huyết thanh học và quan sát triệu chứng bệnh tắch.
- Cách lấy bệnh phẩm:
Trước khi mổ dùng kéo nhọn hoặc dao mổ cắt ựứt phắa sau gáy ựể gà phóng tiết và giết gà tránh dãy dụa, khơng cắt vào cổ gà vì có thể làm ựứt khắ quản, máu sẽ vào khắ quản và phổi gây khó khăn cho việc quan sát bệnh tắch sau này. Sau ựó ựặt ngửa gà trên bàn mổ, dùng kéo cắt một ựường từ miệng xuống xương ức ựể bộc lộ khắ quản, cắt một ựường thứ hai từ bụng vòng sang hai bên sườn tới ựầu xương ức, dùng tay lật ngược khối cơ ngực, bộc lộ toàn bộ khắ quản, nội tạng bên trong.
Lấy khắ quản: dùng kéo cắt ựầu trên và ựầu dưới khắ quản, nhẹ nhàng tách khắ quản ra khỏi cổ gà, rạch khắ quản xem xét bên trong khắ quản.
Lấy phổi ra khỏi lồng ngực: chú ý tránh dập nát, dùng ựầu pink không mấu tách từng phần phổi ra khỏi lồng ngực, sau ựó dùng pink kẹp vào hai bên cuống phổi lấy từng bên phổi, lấy từng bên phổi ra quan sát bệnh tắch ựại thể. Kiểm tra gan, tim, dạ dày, ruột, thận, ...
Bảo quản bệnh phẩm trong tủ lạnh - 200C ựể tiến hành việc nuôi cấy, phân lập, xác ựịnh nguyên nhân gây bệnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xử lý bệnh phẩm:
Lấy 1g bệnh phẩm, dùng kéo cắt nhỏ, nghiền trong cối chày sứ, sau ựó cho vào 9ml nước sinh lý vơ trùng hịa ựều thành huyễn dịch, ựổ vào ống nghiệm nhỏ vơ trùng. Ly tâm 3.000 vịng/ phút trong 20 phút.
Ống nghiệm huyễn dịch bệnh phẩm sau khi ly tâm ựược lấy ra, dung dịch chia làm hai phần trong và cặn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
Dùng bơm tiêm hút 1ml dung dịch phần trong tiếp giáp với phần cặn, pha thành các nồng ựộ (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5).
Sau ựó hút 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng ựộ nhỏ vào các môi trường thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey. Các mẫu ựược ria cấy và ựể vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Trên các ựĩa thạch sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, có thể quan sát thấy hình dạng các loại khuẩn lạc.
- Phân lập vi khuẩn:
Những khuẩn lạc ựiển hình ựược tách ra, ni cấy vào thạch máu, giữ ở 40C ựể xác ựịnh các chỉ tiêu tiếp theo.
2.3.4.5. Phương pháp nhận biết một số loại vi khuẩn - Kiểm tra hình thái, ựặc tắnh ni cấy: - Kiểm tra hình thái, ựặc tắnh ni cấy:
+ Phương pháp nhận biết Streptococcus:
Vi khuẩn hình cầu hoặc hình bầu dục, xếp thành chuỗi, ựường kắnh 0,5 - 1ộm bắt màu gram (+).
Trong môi trường nước thịt: pH=7,6 - 7,8 vi khuẩn mọc tốt, môi trường ựục, sau ựó lắng xuống dưới ựáy làm màu mơi trường trong và ựáy ống nghiệm có cặn.
Trên mơi trường thạch thường, Streptococcus phát triển hình thành khuẩn lạc dạng S, màu trắng nhạt, trơn, nhẵn, tròn, nhỏ.
Trên môi trường Edward: môi trường ựặc hiệu chuyên dùng ựể phân lập, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhỏ, ựường kắnh xấp xỉ 1mm, trịn trơn, bóng láng. Streptococcus tạo vòng dung huyết quanh khuẩn lạc, khuẩn lạc
có màu nâu.
+ Phương pháp nhận biết Pasteurella multocida:
Vi khuẩn có hình trứng hoặc hình bầu dục, hai ựầu trịn, kắch thước một chiều từ 0,2 - 0,4ộm, một chiều từ 0,4 - 1,5ộm. Vi khuẩn bắt màu gram (-)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
Hình 2.1. Sơ ựồ quy trình phân lập mẫu
Mẫu dịch ở( họng, khắ quản, phổi) Thạch thường Thạch máu Thạch MacConkey 370C/ 24h
Chọn khuẩn lạc ựặc trưng, làm tiêu bản nhuộm gram, kiểm tra hình thái
Cấy thạch máu giữ giống Kiểm tra hình
thái ni cấy
Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa: - Sinh indol
- Lên men ựường - Dung huyết Tắnh chất sinh học
Phân lập trên môi trường ựặc biệt, sơ bộ ựịnh loại Tách khuẩn lạc nuôi thuần khiết trên môi trường
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
Làm tiêu bản từ bệnh phẩm, thấy bắt màu ựậm ở 2 ựầu gọi là vi khuẩn lưỡng cực. Tiêu bản làm ở canh trùng thấy vi khuẩn ựứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn.
Trên môi trường nước thịt: sau khi cấy vi khuẩn 24h, môi trường ựục vừa, lắc thấy hiện tượng vẩn mây, ựáy ống có cặn nhày, có khi sinh ra một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường mùi tanh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên môi trường thạch thường: sinh khuẩn lạc dạng S, nhỏ li ti giống hạt sương. Môi trường thạch máu: vi khuẩn không gây dung huyết thạch máu.
Môi trường thạch huyết thanh huyết cầu tố: sau khi cấy 24h, quan sát khuẩn lạc dưới kắnh hiển vi có ựộ phóng ựại 20 lần, góc ựèn chiếu 450, khuẩn lạc phát huỳnh quang.
- Phương pháp nhận biết E. coli:
Vi khuẩn hình gậy ngắn, 2 ựầu trịn, kắch thước 0,6 ừ 2 - 3ộm, ựứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn, bắt màu gram (-).
Trong môi trường nước thịt: nuôi cấy vi khuẩn E. coli có lắng cặn màu tro nhạt, có mùi thối của phân.
Trên mơi trường Macconkey: vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc màu hồng cánh sen.
Trên môi trường thạch thường: thấy khuẩn lạc E. coli thuần dạng S, hơi lồi,trịn, ướt, khơng trong suốt, có màu tro trắng.
Trên mơi trường Kligler: vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc màu vàng.