- Ngoài ra các vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzym phân giải protein có thể làm suy giảm
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Thu thập thông tin
Tất cả đối tượng nghiên cứu được khám lâm sàng và làm xét nghiệm cận lâm sàng theo mẫu bệnh án riêng.
* Khám bệnh
Hỏi bệnh
- Phỏt hiện các triệu chứng cơ năng của người bệnh + Các rối loạn tiểu tiện
+ Rối loạn màu sắc nước tiểu
+ Các triệu chứng toàn thân kèm theo
Khai thác yếu tố nguy cơ
+ Tuổi, giới tính, tình trạng suy dinh dưỡng.
+ Tiền sử mắc các dị dạng thận tiết niệu, bệnh thận mạn tính.
+ Tiền sử bản thân và gia đình (bố, mẹ, anh chị em ruột) bị mắc NKTN và số lần bị tái phát bệnh.
Khám bệnh
Khám toàn thân: Phát hiện các triệu chứng, biến chứng bất thường
Khám bộ phận thận tiết niệu sinh dục: Phát hiện các triệu chứng thực thể và các dị dạng tiết niệu sinh dục ngoài.
* Cận lâm sàng
Xét nghiệm nước tiểu làm test nhanh Multistic trờn mỏy Cliniter advantus của Siemen và soi tươi tế tìm bạch cầu niệu tại bệnh viện Nhi TW.
Các mẫu nước tiểu có kết quả bạch cầu niệu (+) sẽ được lấy nước tiểu ni cấy VK. Cấy nước tiểu tìm VK và làm kháng sinh đồ tại khoa hóa sinh trường Đại học Y Hà nội.
Xét nghiệm huyết học, CRP tại bệnh viện Nhi TW.
Siêu âm thận tiết niệu, chụp UIV, chụp bàng quang khi đái tại khoa chẩn đốn hình ảnh bệnh viện Nhi TW.
Những bệnh nhõn có kết quả cấy vi khuẩn niệu (+) ( ≥ 105vi khuẩn/mL nước tiểu) sẽ được định lượng 25(OH)D3 huyết thanh và LL-37 huyết thanh. Mẫu máu bệnh nhân sau khi lấy không chống đông được ly tâm tách lấy mẫu huyết thanh. Mẫu bệnh phẩm là mỏu khụng chống đông hoặc huyết thanh sau khi lấy được bảo quản tối, ống nghiệm được bọc giấy thiếc để tránh ánh sáng trong quá trình vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -20oC khi lấy đủ số lượng nghiên cứu tiến hành định lượng 25(OH)D3 và LL-37. Mẫu huyết thanh sau khi phỏ đụng tiến hành định lượng 25(OH)D3, LL-37 trong vịng 24h quy trình thực hiện xét nghiệm ở nhiệt độ phịng 18-250C.
* Cấy nước tiểu tìm vi khuẩn
•Lấy nước tiểu
Lấy nước tiểu vào buổi sáng hoặc bất kỳ trong ngày. Lấy nước tiểu đảm bảo vô khuẩn, bỏ nước tiểu đoạn đầu lấy đoạn giữa sau khi đã vệ sinh bộ phận sinh dục hứng vào ống nghiệm đã tiệt trùng, rồi nút lại bằng bụng đó hấp vơ trùng.
•Bảo quản nước tiểu
Nước tiểu sau khi lấy được đem nuôi cấy ngay, nếu không phải bảo quản 0-4oC và cấy nước tiểu trong vịng 4h.
•Phương pháp ni cấy
Dùng ăng cấy chuẩn1/1000ml
Lắc đều ống nước tiểu trước khi cấy
Cấy vào môi trường thạch máu và thạch Chrome.
Ủ trong tủ ấm ở 370C từ 18-24h. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc từ đó tính ra số lượng vi khuẩn trong 1mL nước tiểu.
Sau đó vi khuẩn được cấy vào mơi trường phân lập để định loại vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
Số lượng vi khuẩn được đánh giá như sau: số lượng vi khuẩn /mL nước tiểu ≥105 chẩn đoán NKTN.
Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch của Kirby- Bauer.
Thạch làm kháng sinh đồ là thạch Muller- Hinton
Khoanh giấy kháng sinh của hãng AB-Biodisk Thụy Điển. Xác định độ nhạy cảm kháng sinh theo mức độ nhạy cảm(S), trung gian(I) và khỏng(R)
* Định lượng 25(OH)D3
Nồng độ 25(OH)D3 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (electrochemiluminescence immunoassay). Trên máy Elecsys 2010, kit định lượng 25- Hydroxyvitamin D3 Cat.No 03314847 của Roche Diagnostics tại viện Karolinska Thụy Điển..
Nguyên tắc phản ứng: Nguyên tắc cạnh tranh Toàn bộ các giai đoạn 18 phút
Bước 1: 25(OH)D3 trong mẫu huyết thanh (35àl) được gắn cạnh tranh với vitamin D đã gắn với biotin trong phức hợp R2 (biotin- vitamin D- kháng
thể đa dòng đặc hiệu kháng 25(OH)D3 đánh dấu bởi Ruthelium). Nồng độ phức R2 còn lại phụ thuộc nồng độ 25(OH) D3 trong mẫu.
Bước 2: Thêm streptavidin- coated microparticies, phức hợp trở lên gắn kết thành pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin và streptavidin.
Bước 3: Hỗn hợp phản ứng được hút vào buồng đo lường ở đó nó được giữ lại trên bề mặt điện cực do từ tớnh. Cỏc thành phần không gắn sẽ bi rửa đi cùng với Procell. Sau đó dùng một điện áp và điện cực để kích thích sự phát quang cường độ phát quang được xác định bởi bộ phận đo quang. Kết quả xác định dựa vào một đường cong chuẩn bằng cách chuẩn hai điểm (đặc hiệu cho thiết bị đo) và đường cong gốc được cung cấp dựa vào mã vạch của thuốc thử.
Thuốc thử và dung dịch phản ứng
M Streptavidine-coated microparties, 1lọ 6.5ml
Streptavidine-coated microparties 0.072mg/ml; chất bảo quản
R1 Đệm phản ứng reation buffer, 1lọ 8ml
R2 Anti-25-OH- vitamin D3-Ab-Ru(bpy): 25-OH-vitamin D3 derivate- biotin, 1lọ 9ml
Polyclonal anti-25-OH vitamin D3 antibody (cừu) gắn với phức hợp ruthelium1,5mg/L; biotinyl 25-OH vitamin D 0,15mg/L: phosphatase buffer 20mmol/L, pH 6,5; chất bảo quản
Đánh giá nồng độ 25(OH)D3 được khuyến cáo là đủ vitamin D ≥ 30ng/mL
* Định lượng LL- 37 huyết thanh.
Nồng độ LL-37 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) kiểu sandwich. Kit định lượng LL-37 Cat.No HK321 (Hycult biotechology, Uden, The Netherlands) tại Viện Karolinska.
Toàn bộ các giai đoạn: 3 giờ 30 phút Nguyên tắc phản ứng:
Mẫu và chuẩn được ủ trong giếng có kháng thể LL-37 người. Đưa kháng thể gắn biotin vào gắn với LL-37 người
Phức hợp Streptavidin- peroxidase gắn vào kháng thể có gắn biotin trong phức hợp.
Phức hợp Streptavidin- peroxidase sẽ gây phản ứng trên bề mặt, tetramethylbenzidine (TMB).
Phản ứng enzyme sẽ dừng lại khi thêm acid oxalic.
Kết quả đo sự hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 450nm. Đường cong chuẩn được xác định bằng cách vẽ đường hấp thu tương ứng với với nồng độ LL-37 tiêu chuẩn. LL-37 của mẫu được xác định từ dường cong tiêu chuẩn.