- Ngoài ra các vi khuẩn có khả năng sản xuất các enzym phân giải protein có thể làm suy giảm
1.7.3. Mối tương quan giữa 25(OH)D3 và LL-37
Trên thế giới một số nghiên cứu đã được tiến hành tìm hiểu mối tương quan giữa 25(OH)D3 và LL-37 trên một số nhóm bệnh nhiễm khuẩn khác nhau. Để nhằm mục tiêu tìm hiểu mối quan hệ giữa vitamin D và tình trạng sản xuất LL-37 yếu tố quan trọng với miễn dịch bẩm sinh. Cũng như vai trị tham gia kiểm sốt các bệnh nhiễm trùng tại cộng đồng của vitamin D.
Nghiên cứu trờn nhúm bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết và nhóm bệnh nhân nhiễm trùng nhập viện khác của Jeng L. và cộng sự năm 2009 nhận thấy 25(OH)D3 và LL-37 có mối tương quan thuận tích cực với r= 0,2385 [53].
Tuy nhiên một nghiên cứu khác trên 95 bệnh nhân lao phổi của Yamshchikov và cộng sự được báo cáo 2010 khơng thấy mối tương quan tuyến tính giữa hai đại lượng này. Bài báo chỉ ra rằng nồng độ LL-37 cao liên quan đến tình trạng mất cân (giảm hơn 10% trọng lượng) [80] .
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu.
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi gồm 2 nhúm: nhúm bệnh và nhóm chứng
2.1.1. Nhóm bệnh
* Tiêu chuẩn chọn:
Bệnh nhân nhi (≤15 tuổi) được chẩn đoán xác định là NKTN
Chúng tơi hướng tới các bệnh nhi có biểu hiện lâm sàng gợi ý đến NKTN. Các triệu chứng gợi ý NKTN theo lứa tuổi như sau:
Trẻ sơ sinh: Sốt hoặc hạ thân nhiệt, kém ăn, vàng da, chậm tăng cân, nhiễm khuẩn huyết.
Trẻ bú mẹ: Nơn, ỉa chảy, sốt, kém ăn, đái đục, khóc khi đái. Trẻ lớn: Đái buốt, đái rắt, đái dầm, đái đục, đỏi mỏu, sốt rét run
Kết quả xét nghiệm tổng phân tích và soi tươi tế bào niệu: Bạch cầu niệu (+). Tiêu chuẩn chẩn đốn: Kết quả ni cấy nước tiểu: Vi khuẩn niệu ≥ 105
/mL nước tiểu giữa dòng (tiêu chuẩn Kate Verries John) [55]. Chẩn đoán : NKTN trên: Sốt ≥3805, CRP >20mg/L
NKTN dưới: Sốt < 38o5[55]
2.1.2. Nhóm chứng
Gồm 36 trẻ khỏe mạnh không bị NKTN, không mắc các bệnh thận mạn tính và khơng bị mắc các bệnh nhiễm khuẩn khác như nhiễm khuẩn hô ấp, đường tiêu hóa, nhiễm khuẩn da hoặc những trẻ đến khám sức khỏe định kỳ tương ứng về tuổi và giới với nhóm nghiên cứu.
Tiêu chuẩn: Vi khuẩn niệu(-) Bạch cầu niệu(-)
2.1.3. Cỡ mẫu nghiên cứu
Cỡ mẫu nghiên cứu thuận tiện
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang.
2.2.2. Thu thập thông tin
Tất cả đối tượng nghiên cứu được khám lâm sàng và làm xét nghiệm cận lâm sàng theo mẫu bệnh án riêng.
* Khám bệnh
Hỏi bệnh
- Phỏt hiện các triệu chứng cơ năng của người bệnh + Các rối loạn tiểu tiện
+ Rối loạn màu sắc nước tiểu
+ Các triệu chứng toàn thân kèm theo
Khai thác yếu tố nguy cơ
+ Tuổi, giới tính, tình trạng suy dinh dưỡng.
+ Tiền sử mắc các dị dạng thận tiết niệu, bệnh thận mạn tính.
+ Tiền sử bản thân và gia đình (bố, mẹ, anh chị em ruột) bị mắc NKTN và số lần bị tái phát bệnh.
Khám bệnh
Khám toàn thân: Phát hiện các triệu chứng, biến chứng bất thường
Khám bộ phận thận tiết niệu sinh dục: Phát hiện các triệu chứng thực thể và các dị dạng tiết niệu sinh dục ngoài.
* Cận lâm sàng
Xét nghiệm nước tiểu làm test nhanh Multistic trờn mỏy Cliniter advantus của Siemen và soi tươi tế tìm bạch cầu niệu tại bệnh viện Nhi TW.
Các mẫu nước tiểu có kết quả bạch cầu niệu (+) sẽ được lấy nước tiểu ni cấy VK. Cấy nước tiểu tìm VK và làm kháng sinh đồ tại khoa hóa sinh trường Đại học Y Hà nội.
Xét nghiệm huyết học, CRP tại bệnh viện Nhi TW.
Siêu âm thận tiết niệu, chụp UIV, chụp bàng quang khi đái tại khoa chẩn đoán hình ảnh bệnh viện Nhi TW.
Những bệnh nhõn có kết quả cấy vi khuẩn niệu (+) ( ≥ 105vi khuẩn/mL nước tiểu) sẽ được định lượng 25(OH)D3 huyết thanh và LL-37 huyết thanh. Mẫu máu bệnh nhân sau khi lấy không chống đông được ly tâm tách lấy mẫu huyết thanh. Mẫu bệnh phẩm là mỏu khụng chống đông hoặc huyết thanh sau khi lấy được bảo quản tối, ống nghiệm được bọc giấy thiếc để tránh ánh sáng trong quá trình vận chuyển và bảo quản ở nhiệt độ -20oC khi lấy đủ số lượng nghiên cứu tiến hành định lượng 25(OH)D3 và LL-37. Mẫu huyết thanh sau khi phỏ đụng tiến hành định lượng 25(OH)D3, LL-37 trong vịng 24h quy trình thực hiện xét nghiệm ở nhiệt độ phịng 18-250C.
* Cấy nước tiểu tìm vi khuẩn
•Lấy nước tiểu
Lấy nước tiểu vào buổi sáng hoặc bất kỳ trong ngày. Lấy nước tiểu đảm bảo vô khuẩn, bỏ nước tiểu đoạn đầu lấy đoạn giữa sau khi đã vệ sinh bộ phận sinh dục hứng vào ống nghiệm đã tiệt trùng, rồi nút lại bằng bụng đó hấp vơ trùng.
•Bảo quản nước tiểu
Nước tiểu sau khi lấy được đem nuôi cấy ngay, nếu không phải bảo quản 0-4oC và cấy nước tiểu trong vịng 4h.
•Phương pháp ni cấy
Dùng ăng cấy chuẩn1/1000ml
Lắc đều ống nước tiểu trước khi cấy
Cấy vào môi trường thạch máu và thạch Chrome.
Ủ trong tủ ấm ở 370C từ 18-24h. Sau đó đếm số lượng khuẩn lạc từ đó tính ra số lượng vi khuẩn trong 1mL nước tiểu.
Sau đó vi khuẩn được cấy vào mơi trường phân lập để định loại vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
Số lượng vi khuẩn được đánh giá như sau: số lượng vi khuẩn /mL nước tiểu ≥105 chẩn đoán NKTN.
Làm kháng sinh đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch của Kirby- Bauer.
Thạch làm kháng sinh đồ là thạch Muller- Hinton
Khoanh giấy kháng sinh của hãng AB-Biodisk Thụy Điển. Xác định độ nhạy cảm kháng sinh theo mức độ nhạy cảm(S), trung gian(I) và khỏng(R)
* Định lượng 25(OH)D3
Nồng độ 25(OH)D3 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (electrochemiluminescence immunoassay). Trên máy Elecsys 2010, kit định lượng 25- Hydroxyvitamin D3 Cat.No 03314847 của Roche Diagnostics tại viện Karolinska Thụy Điển..
Nguyên tắc phản ứng: Nguyên tắc cạnh tranh Toàn bộ các giai đoạn 18 phút
Bước 1: 25(OH)D3 trong mẫu huyết thanh (35àl) được gắn cạnh tranh với vitamin D đã gắn với biotin trong phức hợp R2 (biotin- vitamin D- kháng
thể đa dòng đặc hiệu kháng 25(OH)D3 đánh dấu bởi Ruthelium). Nồng độ phức R2 còn lại phụ thuộc nồng độ 25(OH) D3 trong mẫu.
Bước 2: Thêm streptavidin- coated microparticies, phức hợp trở lên gắn kết thành pha rắn thông qua sự tương tác giữa biotin và streptavidin.
Bước 3: Hỗn hợp phản ứng được hút vào buồng đo lường ở đó nó được giữ lại trên bề mặt điện cực do từ tớnh. Cỏc thành phần không gắn sẽ bi rửa đi cùng với Procell. Sau đó dùng một điện áp và điện cực để kích thích sự phát quang cường độ phát quang được xác định bởi bộ phận đo quang. Kết quả xác định dựa vào một đường cong chuẩn bằng cách chuẩn hai điểm (đặc hiệu cho thiết bị đo) và đường cong gốc được cung cấp dựa vào mã vạch của thuốc thử.
Thuốc thử và dung dịch phản ứng
M Streptavidine-coated microparties, 1lọ 6.5ml
Streptavidine-coated microparties 0.072mg/ml; chất bảo quản
R1 Đệm phản ứng reation buffer, 1lọ 8ml
R2 Anti-25-OH- vitamin D3-Ab-Ru(bpy): 25-OH-vitamin D3 derivate- biotin, 1lọ 9ml
Polyclonal anti-25-OH vitamin D3 antibody (cừu) gắn với phức hợp ruthelium1,5mg/L; biotinyl 25-OH vitamin D 0,15mg/L: phosphatase buffer 20mmol/L, pH 6,5; chất bảo quản
Đánh giá nồng độ 25(OH)D3 được khuyến cáo là đủ vitamin D ≥ 30ng/mL
* Định lượng LL- 37 huyết thanh.
Nồng độ LL-37 trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) kiểu sandwich. Kit định lượng LL-37 Cat.No HK321 (Hycult biotechology, Uden, The Netherlands) tại Viện Karolinska.
Toàn bộ các giai đoạn: 3 giờ 30 phút Nguyên tắc phản ứng:
Mẫu và chuẩn được ủ trong giếng có kháng thể LL-37 người. Đưa kháng thể gắn biotin vào gắn với LL-37 người
Phức hợp Streptavidin- peroxidase gắn vào kháng thể có gắn biotin trong phức hợp.
Phức hợp Streptavidin- peroxidase sẽ gây phản ứng trên bề mặt, tetramethylbenzidine (TMB).
Phản ứng enzyme sẽ dừng lại khi thêm acid oxalic.
Kết quả đo sự hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 450nm. Đường cong chuẩn được xác định bằng cách vẽ đường hấp thu tương ứng với với nồng độ LL-37 tiêu chuẩn. LL-37 của mẫu được xác định từ dường cong tiêu chuẩn.
2.3. Xử lý số liệu.
Sử dụng phương pháp thống kê y học và phần mềm Epi-info 6.0 Các thơng số được tính:
- Giá trị trung bình - Độ lệch chuẩn: SD
- Hệ số tương quan: r và viết phương trình đường thẳng hồi quy: y = ax+ b - Cỏc phép so sánh χ2 và test t. Nếu p < 0,5 coi là có ý nghĩa thống kê
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu
- Các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu - Các đối tượng nghiên cứu lấy máu, nước tiểu và phân tích các chỉ số
miễn phí
- Đối tượng hồn tồn có thể rút lui khỏi nghiên cứu khi không muốn tiếp tục tham gia vào nghiên cứu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhi NKTN3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới tính. 3.1.1. Đặc điểm tuổi và giới tính.
Bảng 3.1. Phân bố bệnh nhân theo tuổi và giới tính
< 2 tuổi ≥ 2 tuổi Tổng n % n % n % Nam 21 31,8 18 27,3 39 59,1 Nữ 17 25,8 10 15,1 27 40,9 Tổng 38 57,6 28 42,4 66 100 Nhận xét:
Trẻ trai mắc nhiều hơn trẻ gái và nhóm trẻ dưới 2 tuổi mắc bệnh nhiều hơn. Tuy nhiên sự khác nhau này khơng có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.1.2. Phân loại NKTN.
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ NKTN trên và NKTN dướiNhận xét: Nhận xét:
NKTN trên chiếm tỷ lệ 27,3% (18/66 bệnh nhân). NKTN dưới chiếm tỷ lệ 72,7%
Bệnh nhi dưới 2 tuổi chiếm 66,7% (12/18) trường hợp NKTN trên
3.1.3. Sự biến đổi của một số thông số huyết học
Bảng 3.2. Kết quả xột nghiệm máu
Kết quả xét nghiệm Số bệnh nhân Tỷ lệ %
Hemoglobulin (<11g/dl) 22 33,3 Số lượng bạch cầu >10 G/L 40 60,6 Tỷ lệ bạch cầu trung tính tăng 34 51,5 CRP(>20mg/L) 22 33,3 Nhận xét:
Tỷ lệ bệnh nhân có biểu hiện thiếu máu 33,3%
Bạch cầu máu tăng 60,6% trường hợp. Tăng bạch cầu trung tính 51,5%.
3.1.4. Kết quả xét nghiệm bạch cầu niệu
Bảng 3.3. Kết quả xét nghiệm bạch cầu niệu
Bạch cầu niệu Số bệnh nhân Tỷ lệ %
(+) 1 1.5
(++) 4 6.1
(+++) và dày đặc 61 92.4
Tổng 66 100
Nhận xét:
- Đa số các bệnh nhi có bạch cầu niệu rất nhiều (92,4%).
3.1.5. Kết quả phân lập vi khuẩn
Bảng 3.4. Tỷ lệ các vi khuẩn phân lập được
Vi khuẩn Nam Nữ Chung
n % n % n % E.coli 27 40,9 19 28,8 46 69,7 Proteus 5 7,5 5 7,5 10 15,3 Ent.feacalis 3 4,5 2 3.0 5 7.5 S.aereuse 1 1,5 0 0 1 1,5 Klebsiella 0 0 2 3,0 2 3,0 Samonella 1 1,5 1 1,5 2 3.0 Tổng 39 56,1 29 43,9 66 100 Nhận xét:
VK gây bệnh hàng đầu là E.coli 46 bệnh nhân (69,7%). Khơng có sự khác biệt tỷ lệ nhiễm E.coli theo giới (p>0.05).
3.1.6. Mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli.
Kháng sinh S I R n % n % n % Amoxicilin 9 19.6 1 2.2 36 78.3 Cephalotine 21 45.7 3 6.5 22 47.8 Augmentin 39 84.8 1 2.2 6 23. Cefotaxim 17 37.0 4 8.7 25 54.45 Ceftazidime 33 71.7 6 13.0 7 15.2 Ceftriaxole 23 50 1 2.2 22 47.8 Ciprofloxacin 36 78.3 4 8.7 6 13.0 Gentamycin 28 60.9 1 2.2 17 37.0 Amikacin 41 89.9 1 2.2 4 8.7 Tobramycine 25 54.4 9 19.6 12 26.1 Cotrimoxazol 9 19.6 3 6.5 34 73.9 Fosmicin 45 97.8 0 0 1 2.2 Ertapenem 46 100 0 0 0 0 Nitrofurantoin 45 97.8 0 0 1 2.2
Biểu đồ 3.2. Mức độ nhạy cảm và kháng kháng sinh của E.coli
Nhận xét:
E.coli kháng mạnh với kháng sinh thông thường như Amoxicilin và Co-trimoxazol (78,3% và 73,9%).
Nhạy cảm với kháng sinh Augmentin 84,8%, Amikacin 89,9%, Ciprofloxacin 78,3%, Fosmicin 97,8%, Nitrofurantoin 97,8% và Ertapenem 100%.
Kháng sinh Cephalosporin thế hệ 3 nhạy cảm thấp: cefotaxime 37%, ceftriaxole 50%.
3.2. Kết quả định lượng 25(OH)D3 và peptid LL-37
Chỳng tôi tiến hành định lượng 25(OH)D3 và LL-37 huyết thanh ở 46 trẻ bị NKTN do vi khuẩn E.coli vì trong nghiên cứu E.coli là nguyên nhân gây bệnh chủ yếu thường gặp nhất.
3.2.1. Nồng độ 25(OH)D3
3.2.1.1. Nồng độ 25(OH)D3 nhóm nghiên cứu
Bảng 3.6: So sánh nồng độ 25(OH)D3 nhóm bệnh và nhóm chứngBệnh Chứng Bệnh Chứng n X ± SD (ng/mL) n X ± SD (ng/mL) Nam 27 12.4 ± 5.8 22 22.6±10.3 < 0.05 Nữ 19 12.0 ±6.3 14 23.5± 9.6 < 0.05 Chung 46 12.3 ± 5.9 36 22.9 ±9.9 <0.05 Nhận xét:
Nồng độ 25(OH)D3 nhóm chứng cao hơn nhóm bệnh (p<0.05).
Nồng độ 25(OH)D3 ở cả trẻ trai và gái trong nhóm chứng đều cao hơn so với nhóm bị bệnh (p<0.05).
Sự khác biệt về nồng độ 25(OH)D3 theo giới tính ở cả hai nhóm nghiên cứu khơng có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.2.1.2. Phân bố nồng độ 25(OH) D3 theo nhóm tuổi
Bệnh Chứng
n (ng/mL)X ± SD n (ng/mL)X ± SD
< 2 tuổi 25 12.4 ± 6.1 20 24 ± 9.9 < 0.05
≥ 2 tuổi 21 12.2 ± 5.8 16 21.7± 10.1 < 0.05
Nhận xét:
Nồng độ 25(OH)D3 ở nhóm bị bệnh dưới 2 tuổi và nhóm trẻ lớn đều thấp hơn nhóm khơng bị bệnh (p<0.05).
Khơng có sự khác biệt nồng độ 25(OH)D3 giữa các nhóm tuổi cả 2 nhóm nghiên cứu.
3.2.1.3.Tình trạng dinh dưỡng vitamin D ở hai nhóm nghiên cứu. Bảng 3.8. Tình trạng dinh dưỡng vitamin D
25(OH)D3 Nhóm bệnh Nhóm chứng
n % n %
Thiếu 46 100 9 25
Đủ 0 0 27 75
Nhận xét:
100% số bệnh nhi bị NKTN thiếu vitamin D (nồng độ 25(OH)D3
< 30ng/mL).
75% số trẻ không bị NKTN thiếu vitamin D (nồng độ 25(OH)D3
< 30ng/mL).
3.2.2. Nồng độ LL-37
3.2.2.1. Nồng độ LL-37 nhóm trẻ NKTN và nhóm khơng bị bệnh Bảng 3.9. So sánh nồng độ LL-37 ở hai nhóm nghiên cứu
n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL Nam 27 15,8 ±4 ,4 22 21,8 ± 5,5 < 0.05 Nữ 19 16,7 ± 6,1 14 17,8 ± 5,7 >0.05 Chung 46 16,2 ± 5,1 36 20,3 ± 5,9 >0.05 Nhận xét:
Nồng độ LL-37 nhóm trẻ trai trong nhóm chứng cao hơn trẻ trai bị NKTN (p<0.05).
Xét chung nồng độ LL-37 ở nhóm chứng cao hơn nhóm trẻ bị NKTN. Nhưng sự khác biệt này khơng có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
Khơng có sự khác biệt về nồng độ LL-37 theo giới tính ở cả hai nhóm nghiên cứu (p>0.05).
3.2.2.2. Phân bố nồng độ LL-37 theo nhóm tuổi
Bảng 3.10. So sánh nồng độ LL-37 theo nhóm tuổi Bệnh Chứng n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL < 2 tuổi 25 15.7 ± 4.3 20 19.2± 5.04 > 0.05 ≥ 2 tuổi 21 16.7 ± 6.1 16 21.56 ± 6.73 > 0.05 Nhận xét:
3.2.3. Nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 ở nhóm NKTN trên và NKTN dưới
Bảng 3.11. So sánh nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 theo vị trí nhiễm khuẩn
NKTN trên NKTN dưới p n X ± SD ng/mL n X ± SD ng/mL 25(OH)D3 17 36.4±17.5 29 27.2±12.1 >0.05 LL-37 17 17.3±5.9 29 15.5±4.7 >0.05 ơNhận xét:
Nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 ở các bệnh nhi NKTN trên và dưới khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0.05).
3.3. Liên quan nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 huyết thanh.3.3.1. Nhóm chứng 3.3.1. Nhóm chứng
Biểu đồ 3.3. Tương quan nồng độ 25(OH)D3 và LL-37 nhóm chứngNhận xét: Nhận xét:
Tương quan thuận khá chặt chẽ (r2 =0.3742, r=0.61, 0.04 < r2 <0.56) theo phương trình: y = 0.1456x + 11.894 (y là nồng độ LL-37, x là nồng độ 25(OH)D3)
3.3.2. Nhóm bệnh
Biểu đồ 3.4. Tương quan nồng độ 25(OH) D3 và LL-37 nhóm bệnhNhận xét: Nhận xét:
Tương quan khá chặt chẽ ( r2= 0.352, r=0.57, 0.05 <r2< 0.63) đồng biến theo phương trình: y= 0.1975x + 10.098.
3.3.3. Mối tương quan giữa số lượng bạch cầu máu và LL-37.