hợp vào các liên kết đôi trong phân tử chất béo không no. Chỉ số iod đặc trưng cho số lượng các acid béo không no trong thành phần của chất béo; khả năng ổn định của chất béo đối với sự oxy hóa, polimer hóa và các biến đổi khác.
Chuẩn bị các dung dịch: ethanol tuyệt đối hoặc 96%; dung dịch iod 0,1N trong cồn; dung dịch sodium thiosulfate (Na2S2O3) 0,1N, dung dịch tinh bột 1%.
Mẫu chất béo được cân chính xác trọng lượng, cho vào bình tam giác nút nhám; bổ sung vào bình 10 mL ethanol 96% và 10 mL dung dịch iod 0,1N; lắc đều, đậy kín bình bằng nút nhám và để yên trong tối khoảng 18 giờ. Bình đối chứng sử dụng nước cất thay cho mẫu. Sau 18 giờ phản ứng, chuẩn độ bình đối chứng và bình thí nghiệm bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt, thêm vào mỗi bình vài giọt dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch mất màu xanh.
Chỉ số iod được tính theo công thức sau:
IV = [(VK – VT) x 12,7 x 100]/ a
Trong đó: VK là thể tích dung dịch Na2S2O3 0,1N chuẩn độ bình đối chứng;
VT là thể tích dung dịch Na2S2O3 0,1N chuẩn độ bình thí nghiệm;
12,7 là số mg I2 tương đương với 1 mL I2 0,1N;
2.2.9. Phƣơng pháp xác định khối lƣợng riêng bằng tỷ trọng kế
(TCVN6594:2007)
Khối lượng riêng (density) là khối lượng của chất lỏng trên một đơn vị thể tích chất lỏng ở 15o
C và 101,325 kPa. Đơn vị đo lường tiêu chuẩn là kg/m3.
Mẫu được đưa về nhiệt độ quy định và một phần mẫu được rót vào ống đong có nhiệt độ xấp xỉ bằng nhiệt độ của mẫu thử. Tỷ trọng kế có nhiệt độ tương tự được thả vào phần mẫu thử và để yên. Sau khi nhiệt độ đạt cân bằng, đọc kết quả trên thang đo của tỷ trọng kế và ghi lại nhiệt độ của mẫu lúc đó. Áp dụng các bảng đo lường về dầu mỏ quy đổi số đọc tỷ trọng kế đã quan sát được về nhiệt độ chuẩn. Nếu cần thiết đặt ống đong tỷ trọng và mẫu chứa trong đó vào bể ổn nhiệt để tránh sự thay đổi nhiệt độ quá lớn trong quá trình đo.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu sinh trƣởng của vi tảo biển quang tự dƣỡng
Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sinh trưởng của 7 loài vi tảo biển quang tự dưỡng nói trên ở các quy mô 100, 250, 500 và 1000mL. Kết quả thu được về sinh trưởng của tảo được thể hiện ở các đồ thị hình 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.
Hình 11. Sinh trƣởng của tảo N.oculata trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở hình 11 cho thấy N. oculata đạt MĐTB cực đại ở bình nuôi 100mL là 155,04 x 106
TB/mL sau 14 ngày; 250mL - 204,35 x 106TB/mL sau 28 ngày; 500mL -199,10 x 106TB/mL sau 28 ngày, 1L – 148,80 x 106TB/mL sau 32 ngày. Thời gian sinh trưởng của N. oculata có pha tiềm ngắn (từ 2-4 ngày), pha cân bằng duy trì trong thời gian khá dài (20-28 ngày).
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Tetraselmis sp. trong các thể tích khác nhau được chỉ ra ở hình 12.
Thời gian (ngày)
Hình 12. Sinh trƣởng của tảo Tetraselmis sp. trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả chỉ ra ở hình 12 cho thấy đối với Tetraselmis sp., trong 2 - 4 ngày đầu, tế bào sinh trưởng châ ̣m, mâ ̣t đô ̣ tế bào giảm so với mâ ̣t đô ̣ ban đầu do sự thích nghi của tế bào trong điều kiện nuôi mới . Sau đó, tế bào bắt đầu sinh trưởng nhanh và đa ̣t mâ ̣t đô ̣ cực đa ̣i là 5,89 x 106
TB/mL sau 14 ngày ở thể tích bình nuôi 100mL. Có sự khác biệt rõ rệt về sinh trưởng của tảo ở bình nuôi thể tích 100mL so với các thể tích bình nuôi khác . Ở thể tích bình nuôi 250, 500 và 1000mL, sinh trưởng c ủa tảo
Tetraselmis sp. hầu như không khác biệt nhiều và có thể đạt được m ật độ cực đa ̣i từ 4,34 - 4,41 x 106TB/mL trong khoảng 18 đến 20 ngày.
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Chlorella sp. trong các thể tích khác nhau được chỉ ra ở hình 13.
Kết quả chỉ ra ở hình 13 cho thấy đối với tảo Chlorella sp., trong 4 ngày đầu nhìn chung MĐTB tăng chậm ở tất cả các bình nuôi có thể tích khác nhau và đạt khoảng 9,88 x 104TB/ml - 12,19 x 104TB/ml. MĐTB ở các bình thí nghiệm bắt đầu có sự thay đổi khác nhau từ ngày thứ 6. Trong tất cả các bình nuôi, bình 100mL có đường cong sinh trưởng đặc trưng nhất: MĐTB tăng nhanh từ ngày nuôi thứ 6 (14,67 x 106 tb/mL) và đạt cực đại vào ngày nuôi thứ 14 (32,16 x 106 TB/ml), giảm nhẹ ở ngày thứ 16, giảm nhanh hơn sau 18 ngày, đến ngày thứ 20 - 26 mật độ tế bào
Thời gian (ngày)
lại có xu hướng tăng lên (27,48 x 106 TB/ml – 32,16 x 106 TB/ml), sau đó lại tiếp tục giảm nếu tiếp tục kéo dài thời gian nuôi.
Hình 13. Sinh trƣởng của tảo Chlorella sp. trong các thể tích bình khác nhau
Ở bình 250 mL, MĐTB đạt cực đại sau 18 ngày nuôi cấy (33,68 x 106
TB/mL) và MĐTB duy trì ở mức trên 26 triệu cho đến ngày nuôi thứ 26, sau đó giảm và cho đến ngày nuôi thứ 29 vẫn ở mức trên 20 triệu. Pha cân bằng của tảo trong trường hợp này duy trì khá dài (khoảng 20 ngày).
Ở bình 500 mL, MĐTB đạt cực đại (26,88 x 106
TB/ml) sau 26 ngày nuôi cấy và bắt đầu giảm từ ngày nuôi thứ 29.
Ở bình 1 lít, MĐTB đạt cực đại (32 x 106
TB/ml) sau 18 ngày. Pha cân bằng duy trì từ ngày nuôi thứ 18 đến ngày thứ 26 (31,1 x 106TB/ml).
Nhìn chung, tảo Chlorella sp. có thời gian sinh trưởng khá dài, có thể lên tới 29 ngày nhưng mật độ tế bào giảm không đáng kể. Chlorella sp. có pha tiềm ngắn, khoảng 4 ngày; thời gian giữ ở trạng thái cân bằng trên 20 ngày. Đây chính là một thế mạnh của loài Chlorella sp. nếu chúng được sử dụng để nuôi trồng trên qui mô lớn sẽ cho phép kéo dài hoạt động của bể nuôi góp phần làm giảm chi phí sản xuất sinh khối tảo thu được so với các loài tảo khác.
Thời gian (ngày)
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Isochrysis galbana ở các thể tích bình nuôi khác nhau được chỉ ra ở hình 14.
Hình 14. Sinh trƣởng của tảo I. galbana trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở hình 14 đã cho thấy Isochrysis galbana sinh trưởng tốt nhất ở bình nuôi có th ể tích 100mL và MĐTB đạt cực đa ̣i là 5,65 x 106TB/mL sau 10 ngày. Ở các thể tích 250, 500 và 1000mL, MĐTB tăng ít hơn so với ở bình nuôi có thể tích 100mL và MĐTB cực đại dao động trong khoảng 4,40 x 106TB/mL đến 4,66 x 106TB/mL sau khoảng 10 ngày nuôi cấy. Nhìn chung, tảo có thời gian sinh trưởng ngắn (10-14 ngày) và tương đối ổn định trong suốt thời kỳ sinh trưởng.
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Chaetoceros muelleri ở các thể tích bình nuôi khác nhau được chỉ ra ở hình 15.
Thời gian (ngày)
Hình 15. Sinh trƣởng của tảo C.muelleri trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở hình 15 cho thấy tảo Chaetoceros muelleri
sinh trưởng tốt nhất trong bình nuôi có thể tích 100mL, pha cân bằng duy trì từ ngày nuôi thứ 12 đến ngày nuôi thứ 16 và MĐTB đạt cực đa ̣i là 4,69 x 106
TB/mL sau 16 ngày. Ở bình 250mL, trạng thái cân bằng đạt được từ ngày nuôi thứ 8 và kéo dài đến ngày thứ 16, MĐTB cực đại đạt 4,08 x106
TB/mL sau 16 ngày. Ở bình 500mL và bình 1 lít, nhìn chung MĐTB ở các ngày nuôi cấy thấp hơn và đường cong sinh trưởng của tảo dao động nhiều hơn so với các bình có thể tích nhỏ; và mặc dù MĐTB cực đại đạt được thấp hơn nhưng thời gian đạt cực đại lại sớm hơn so với các bình có thể tích nhỏ (bình 500 mL đạt cực đại 3,88 x106TB/mL sau 14 ngày và bình 1000mL - 3,12 x106TB/mL sau 10 ngày).
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Chroomonass salina trong các thể tích bình nuôi khác nhau được chỉ ra ở hình 16.
Thời gian (ngày)
Hình 16. Sinh trƣởng của tảo C. salina trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở hình 16 cho thấy tảo Chroomonas salina
sinh trưởng tốt và MĐTB tăng cao rõ rệt ở pha cân bằng so với pha tiềm và pha sinh trưởng logarit. Ở tất cả các bình nuôi có thể tích khác nhau, đường cong sinh trưởng không khác nhau nhiều và thời gian đạt MĐTB cực đại dao động trong khoảng từ ngày nuôi thứ 13 đến ngày thứ 17. Cụ thể: ở bình nuôi 100 ml MĐTB đạt cực đại 9,31 x 106TB/mL sau 17 ngày, bình 250mL đạt 7,87 x 106TB/mL sau 15 ngày, bình 500mL đạt 6,90 x 106
TB/mL sau 17 ngày và bình 1 lít đạt 4,8 x 106TB/mL sau 13 ngày. Như vậy, cũng tương tự như đối với đa số các loài tảo khác trong nghiên cứu này, C. salina cũng có đặc điểm MĐTB cực đại đạt được ở các bình có thể tích lớn thường thấp hơn nhưng thời gian đạt cực đại lại sớm hơn so với các bình có thể tích nhỏ.
Đồ thị mô tả sinh trưởng của tảo Dunaliella tertiolecta trong các thể tích bình nuôi khác nhau được chỉ ra ở hình 17.
Thời gian (ngày)
Hình 17. Sinh trƣởng của tảo D. tertiolecta trong các thể tích bình khác nhau
Kết quả nghiên cứu được chỉ ra ở hình 17 cho thấy D. tertiolecta sinh trưở ng tốt nhất ở bình nuôi có th ể tích 100mL và đa ̣t mâ ̣t đô ̣ t ế bào cực đa ̣i là 5,96x106TB/mL sau 22 ngày nuôi cấ y. Mật đô ̣ tế bào tăng đáng kể so với mâ ̣t đô ̣ ban đầu từ 0,55 x 106
TB/mL đến mật đô ̣ cực đa ̣i là 5,96 x106
TB/mL. Ở các thể tích 250, 500 và 1000mL, MĐTB cực đại thấp hơn so vớ i ở bình nuôi có thể tích 100mL. Cụ thể: bình 250 mL đạt MĐTB cực đại là 4,50 x106TB/mL sau 18 ngày, bình 500mL đạt 4,42 x106
TB/mL sau 22 ngày và bình 1000mL đạt 3,06 x106TB/mL sau 22 ngày. Nhìn chung, thời gian đạt MĐTB cực đại của D. tertiolecta ở các thể tích bình nuôi khác nhau thì không khác nhau nhiều, dao động từ 18-22 ngày.
Tóm lại, từ các kết quả thu được về sinh trưởng của 7 loài VTB nghiên cứu được trình bày trên đây, chúng tôi có nhận xét chung như sau: ở các thể tích bình nuôi khác nhau thì động thái sinh trưởng của tảo cũng có những đặc trưng khác nhau, tùy vào mục đích nuôi trồng để chọn quy mô phù hợp. Bình 100 mL thích hợp nhất cho mục đích giữ giống còn khi cần nuôi thu sinh khối thì nên chọn các thể tích lớn vì ở thể tích lớn thời gian đa ̣t mật độ tế bào cực đa ̣i nhanh hơn và hiê ̣u quả cao hơn. Thời gian đạt mật độ tế bào cực đại thay đổi khác nhau tùy từng loài.
Thời gian (ngày)
Qua quá trình nghiên cứu sinh trưởng, chúng tôi nhận thấy cả 7 loài VTB quang tự dưỡng của Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu này đều có thể được nuôi trồng ở quy mô phòng thí nghiệm, quy mô pilot và có khả năng cho phép nhân nuôi ở các quy mô lớn hơn để thu sinh khối tảo. Các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng có thể dễ dàng được đảm bảo phù hợp cho sinh trưởng của tảo. Trong số đó,
Nannochloropsis oculata và Chlorella sp. có khả năng sinh trưởng tốt khi tăng thể tích bình nuôi so với các loài còn lại.
Hình thái tế bào của 7 loài vi tảo biển nghiên cứu được thể hiện ở hình 18.
Hình 18 . Hình thái tế bào của 7 loài vi tảo biển đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
Nannochropsis oculata Tetraselmis sp.
Chlorella sp.
Dunaliella tertiolecta
Isochrypsis galbana Chaetoceros muelleri
3.2. Xác định mối tƣơng quan giữa MĐTB và OD
Từ sự biến thiên về MĐTB và OD theo thời gian, chúng tôi đã xây dựng mối quan hệ giữa 2 đại lượng này ở các loài vi tảo biển được sử dụng trong nghiên cứu. Đồ thị biểu diễn mối tương quan và phương trình tương quan giữa 2 đại luợng nêu trên của 7 loài vi tảo được thể hiện ở hình 19.
OD 680 y = 0.1711x - 0.0029 R2 = 0.9907 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 2 4 6 8 MĐTB (triệu TB/ML) O D ( 68 0 n m ) A OD 680 y = 0.1495x + 0.0854 R2 = 0.9317 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 2 4 6 MĐTB (triệu TB/ML) O D ( 68 0 n m ) B OD 680 MĐTB (x 106 tb/mL) MĐTB (x 106 tb/mL)
y = 0.0299x - 0.1704 R2 = 0.9791 0 0.5 1 1.5 2 0 20 40 60 80 M ĐTB (triệu tb/ml) O D ( 6 8 0 n m ) C y = 0.0978x - 0.0748 R2 = 0.943 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0 5 10 15 MĐTB (Triệu TB/ML) O D ( 6 8 0 n m ) E y = 0.011x + 0.1923 R2 = 0.9861 0 0.5 1 1.5 2 0 50 100 150 MĐTB (triệu TB/ML) O D ( 6 8 0 n m ) D OD 680 OD 680 OD 680 MĐTB (x 106 tb/mL) MĐTB (x 106 tb/mL) MĐTB (x 106 tb/mL)
F
OD
680
Hình19. Đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD của 7 loài vi tảo biển: A-Dunaliella tertiolecta, B- Tetraselmis sp., C- Chlorella sp.,
D- Nannochropsis oculata, E- Isochrypsis galbana,
F- Chaetoceros muelleri, G- Chroomonas salina
MĐTB (x 106 tb/mL) y = 5.2245x + 0.6386 R2 = 0.8918 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 9.000 10.000 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400
Tương quan giữa mật độ quang OD và mật độ tế bào MD của C.muelleri y = 5.2245x + 0.6386 R2 = 0.8918 F OD ( 6 8 0 n m ) OD 680 OD 680 MĐTB (x 106 tb/mL) G
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 19 cho thấy trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi, đối với các loài Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sp.,
Chlorella sp., Nannochropsis oculata, Isochrypsis galbana, Chaetoceros muelleri, Chroomonas salina, tương quan giữa MĐTB và OD là tương quan khá chặt, giá trị R2 tương ứng là 0,99; 0,93; 0,979; 0,986, 0,94, 0,89 và 0,953. Vì vậy, có thể sử dụng phương trình tương quan để tính giá trị MĐTB hoặc OD khi biết một trong các giá trị kia, nhờ đó có thể giảm bớt công lao động khi nuôi cấy các loài vi tảo này trên qui mô lớn.
Hình 20 minh họa hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dưỡng ở các quy mô khác nhau (từ bình 250 mL đến bình 10 lít).
Hình 20. Hệ thống nuôi trồng các loài vi tảo biển quang tự dƣỡng ở các quy mô bình từ 250 mL đến bình 10 lít
3.3. Kết tủa sinh khối tảo bằng phƣơng pháp hóa học
Như chúng ta đã biết, hạn chế lớn nhất hiện nay của biodiesel được sản xuất từ tảo là vấn đề giá thành sản xuất. Do đó, để có thể giảm chi phí sản xuất sinh khối vi tảo làm nguyên liệu cho sản xuất NLSH, vấn đề cần được quan tâm hàng đầu là phải giảm chi phí sản xuất ở tất cả các khâu của quy trình công nghệ nuôi từ khâu giống sơ cấp, thứ cấp, đến hệ thống nuôi trồng trên qui mô lớn, thu hoạch sinh khối tảo, lưu giữ bảo quản sinh khối tảo... Chính vì vậy, để góp phần làm giảm chi phí sản xuất sinh khối tảo, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khả năng thu hoạch sinh khối tảo bằng phương pháp hoá học để từng bước thay thế cho phương pháp ly tâm, hay lọc qua lưới vải (đối với loài tảo có kích thước tế bào lớn)... thường đòi hỏi nhiều thời gian và rất tốn năng lượng, bởi vì thu hoạch sinh khối tảo là một trong các khâu quan trọng quyết định đến chất lượng và giá thành của sản phẩm NLSH thu được.
Dịch huyền phù của 5 loài tảo Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sp., N. oculata, Chaetoceros muelleri và Chlorella sp. được sử dụng cho thí nghiệm kết tủa sinh khối tảo bằng phương pháp hóa học. Thí nghiệm được tiến hành với các thể