Dùng phản ứng RT - PCR phân tắch mẫu máu (ựược lấy trong giai ựoạn ựầu của pha cấp tắnh) ựể xác ựịnh sự có mặt của virus, ựây là phản ứng tương ựối nhạy và chắnh xác.
Kỹ thuật RT Ờ PCR hay còn gọi là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một ựoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai ựoạn: Giai ựoạn thứ nhất là chuyển ựổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau ựó qua giai ựoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn ựể tiếp tục thực hiện phản ứng PCR.
Hình 1.6 . Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR
RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong ựó có Adenine, Guanine, Cystein, Uracil. Chuỗi nucleotit này phải ựược chuyển ựổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil ựược thay thế bằng Thyaminẹ Phản
ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ ựến vai trò của enzyme phiên mã ngược. Do vậy giai ựoạn này ựược gọi là giai ựoạn chuyển ngược. Khi ựã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR. Toàn bộ phản ứng nhân một ựoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai ựoạn nói trên ựược gọi là phản ứng RT- PCR hay phản ứng PCR ngược. Thay ựổi nhiệt ựộ ựể phù hợp cho mỗi chu kỳ (Lê Thanh Hoà, 2006).
Có thể phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch amidanẦTuy nhiên virus PRRS có ựặc ựiểm khó phân lập và khó quan sát bệnh tắch tế bàoẦ Virus thắch hợp nhất trên tế bào ựại thực bào ở phổi lợn, tuy nhiên mỗi lần phân lập ựều phải sản xuất lại tế bào, giữa các lô tế bào ựược sản xuất ra có sự biến ựổi khác nhau và ựộ mẫn cảm với virus PRRS cũng khác nhaụ Trong phòng thắ nghiệm PRRS thắch ứng trên các loại tế bào như: CL2621, PAM, Marc-145Ầtrong ựó tế bào thận khỉ Châu Phi Marc-145 thường ựược sử dụng nhiều nhất (Anette, 1997) [14].
CHƯƠNG II
đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. đối tượng và ựịa ựiểm nghiên cứu
- đối tượng nghiên cứu: + Lợn con theo mẹ + Lợn con sau cai sữa + Lợn choai
+ Lợn nái mang thai + Lợn nái nuôi con
- địa ựiểm nghiên cứu : Khu vực Phúc Sơn và Hạnh Sơn huyện Văn Chấn. Phòng Thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ sinh học Thú y, khoa Thú y, đH Nông nghiệp Hà Nộị
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xác ựịnh triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc bệnh PRRS. - Nghiên cứu bệnh tắch ựại thể của lợn mắc PRRS.
- Nghiên cứu bệnh tắch vi thể của lợn mắc PRRS.
- Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR ựể chẩn ựoán lợn mắc PRRS.
2.3. Nguyên liệu
2.3.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm ựược sử dụng trong nghiên cứu là: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá lách, thậnẦ. của các nhóm lợn mắc PRRS.
2.3.2. Hóa chất
Hóa chất sử dụng làm tiêu bản vi thể, nhuộm hóa miễn dịch: formol 10%, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm haematoxylin, thuốc nhuộm eosin,
kháng kháng thể PRRS, kháng thể tương ứng chuẩn ựoán PRRS, muối NaHCOɜ, kit RT-PCR, hóa chất cho tách chiết RNA của virus.
2.3.3. Dụng cụ
- Tủ lạnh, tủ ấm 37ỨC, tủ sấy, buồng cấy vô trùng.
- Máy ựúc tự ựộng, máy cắt Microton, máy ly tâm lạnh, máy votex, máy PCR, máy chạy ựiện li, máy chụp ảnh gel.
- Các dụng cụ khác gồm: Lam kắnh, kắnh hiển vi, ống eppendoft, pipet, găng tayẦ
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp quan sát
để xác ựịnh ựược triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn mắc PRRS, chúng tôi tiến hành quan sát, ghi chép, thống kê các biểu hiện của lợn từ khi xuất hiện những dấu hiệu bệnh lý ựầu tiên. đồng thời dựa vào các ựặc ựiểm dịch tễ học, những can thiệp trong quá trình bệnh xảy ra cũng như thu thập các thông tin liên quan. Tiến hành phân tắch, thống kê ựể ựưa ra những kết quả chắnh xác. Xác ựịnh chắnh xác những triệu chứng lâm sàng chủ yếu có ý nghĩa vô cùng quan trọng cho các bước thắ nghiệm tiếp theọ
2.4.2. Phương pháp mổ khám
để xác ựịnh ựược các biến ựổi ựại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PRRS cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh ựược cố ựịnh cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng và quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: Phổi, hạch phổi, tim, gan, lá láchẦ ngâm trong fomol 10% làm tiêu bản vi thể.
2.4.3. Phương pháp làm tiêu bản kiểm tra bệnh tắch vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu
bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Khử formol.
+ Mục ựắch ựể rửa sạch formol.
+ Sau khi cố ựịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 Ờ 10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có ựộ dài 4-5 mm. Sau ựó ựem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
- Khử nước
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống nước thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn. + Cồn 900I: 3 giờ. + Cồn 900II: 3 giờ. + Cồn 1000I: 4 giờ. + Cồn 1000II: 12 giờ. - Khử cồn
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc ựựng xylen.
+ Xylen I: 4 giờ. + Xylen II: 4 giờ. + Xylen III: 12 giờ. - Khử xylen.
Cho qua hệ thống 3 cốc ựựng paraffin. + Paraffin I: 6 giờ (Ở 560C).
+ Paraffin II: 6 giờ (Ở 560C). + Paraffin IIỊ 12 giờ (Ở 560C).
- đúc Block.
+ đổ paraffin lỏng vào khuôn. Dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn ựể gắp miếng tổ chức ựặt vào khuôn.
+ Chừng 10 giây chất paraffin lỏng tiếp xúc với khuôn ựã tạo nên một màng mỏng và khi ựó bệnh phẩm ựã ựược ựịnh hướng. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block.
+ Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn và gắn nhãn tránh nhầm lẫn. - Cắt tiêu bản.
Cắt và dán mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ựộ dày 2 - 3ộm. Miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ựược tãi phẳng trên phiến kắnh nhờ cho vào bình nước ấm. Chờ cho miếng tổ chức khô cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ. - Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxylin-Eosin. Các bước nhuộm như sau:
+ Tẩy paraffin: Cho qua hệ thống 3 lọ xylen. Xylen I: 1h, Xylen II: 1h, Xylen III: 1h.
Sau ựó phải lau hết phần xylen quanh tiêu bản rồi chuyển sang cồn. + Tẩy Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm hai lọ cồn ethylic.
Lọ 1: Cồn 1000 I: 10 phút, Lọ 2: Cồn 1000 II: 10 phút, Lọ 3: Cồn 1000: 10 phút.
+ Nhuộm Hematoxylin:
Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 10 phút ta ựem lau khô nước xung quanh tiêu bản, ựặt tiêu bản lên trên giá ựể rồi nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản, ựể trong vòng 10 - 15 phút. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxylin thừạ đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc, nêu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu
ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giâỵ
+ Nhuộm Eosin:
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 10 phút tùy theo thực tế màu eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết eosin thừạ Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi cho vào nước cất ở lam kắnh.
+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống Cồn 900I: 15 giâỵ
Cồn 1000I: 15 giâỵ Cồn 1000II: 15 giâỵ
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua xylen Ị Rồi sang xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kắnh rối chuyển sang xylen III rồi sang xylen IV, sau ựó cho vào xylen ựã làm nóng trong tủ ấm 370 trong vòng 2 phút.
- Gắn Baume canadạ
Nhỏ một giọt Baume canada, xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
- đánh giá kết quả.
đem soi kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.
2.4.4. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) IHC)
Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (IHC) có quy trình tẩm ựúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể.
Các bước nhuộm
Bước 1: Làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dưới vòi nước rửa lại tiêu bản bằng nước cất.
Bước 2: Hoạt hóa enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ướt ở 121ỨC/5 phút Bước 3: Khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi Methanol (1 H2O2 30%: 9 Methanol. Ngâm tiêu bản trong 10 phút).
Bước 4: Gắn kháng thể (KT) Nhỏ 80ộ1 KT PRRS/ tiêu bản
để tủ ấm 37ỨC 1 giờ hoặc 4ỨC/ qua ựêm
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 lần (5 phút/lần) Bước 5: Gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/ tiêu bản để tủ ấm 37ỨC/1h
Rửa PBS 3 lần (5 phút/lần) Bước 6: Cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 5 - 8 phút
Kiểm tra dưới kắnh hiển vi thường: Nếu nhìn thấy màu thì rửa tiêu bản qua nước; nếu không thì ngâm tiếp tiêu bản trong DAB ựến khi nhìn thấy màụ
Bước 7: Nhuộm nhân tế bào bằng Haematoxylin (30s), làm sạch, gắn Baume canada lên lamen nhanh trên tiêu bản và quan sát bằng kắnh hiển vi quang học.
2.4.5. Phương pháp RT-PCR
a) Chiết tách RNA
RNA của virus ựược tách chiết bằng Kit, quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer (AVL +AVE-carier RNA ựể dùng cho kit) (5.6 ml AVL + 56 ộl AVE- carier RNA cho 10 mẫu)
Bước 1: cho 560 ộl buffer vào ống eppendorff Bước 2: Thêm 140 ộl mẫu cần tách chiết
Bước 3: ly tâm ngắn
Bước 4: Ủ nhiệt ựộ phòng 10 phút Bước 5: Thêm 560 ộl cồn 96 - 1000
Votex 15 giây
Spin down loại bỏ các giọt trên nắp
Bước 6: Hút 630 ộl từ ống eppendorff vào cột QIA Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại Bước 8: Thêm 500 ộl AW1
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 9: Thêm 500 ộl AW2
Ly tâm14.000 vòng/phút trong 3 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 10: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ hoàn toàn AW2
Bước 11: đặt cột QIA sang ống eppendorff sạch Thêm 60 ộl AVE
Ủ nhiệt ựộ phòng 1 phút
Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút Bước 12: Lặp lại bước 11 (nếu cần)
Thêm 30 ộl AVE vào cột QIA Ủ nhiệt ựộ phòng 1 phút
Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Thu ựược 60 ộl dịch chiết RNA, bảo quản ở nhiệt ựộ -200C
b) Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl)
2X Reaction Mix 12.5
Mẫu RNA 5
Primer Forwad 0.5
Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước Deion 6
Tổng thể tắch 25
Với trình tự mồi như sau:
Primer Forwad: GAG ACC ATG AGG TGG GCA AC Primer Reverse: CGC CAA AAG CAC CTT TTG T
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp cADN 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 30 giây 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
c) điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi sóng, ựể nguội ựến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện dị
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE 1X ựến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR ựã trộn với loading dye vào các giếng với thể tắch 6ộl maker 100bp và 10ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khái quát về ựiều kiện Tự nhiên - Kinh tế - Xã hội huyện Văn Chấn
Văn Chấn là một huyện miền núi nằm ở phắa tây của tỉnh Yên Bái có vị trắ ựịa lý từ 21020' - 21045' vĩ ựộ bắc, 104020' - 104023' ựộ kinh ựông, tiếp giáp với các ựịa phương: Phắa Bắc giáp huyện Mù Cang Chải; Phắa Nam giáp tỉnh Sơn La và Phú Thọ; Phắa đông giáp huyện Văn Yên và Trấn Yên; Phắa tây giáp huyện Trạm Tấụ
Tổng diện tắch tự nhiên toàn huyện là 120.758,5ha tương ựương với 1.207,585 Km2 chiếm 17,5% diện tắch toàn Tỉnh và là huyện có diện tắch lớn thứ 2 trong tỉnh. Huyện Văn Chấn có 31 ựơn vị hành chắnh (3 thị trấn và 28 xã); trong ựó có 16 xã ựặc biệt khó khăn và 28 thôn bản của xã vùng II thuộc diện ựặc biệt khó khăn.
Huyện lỵ cách thành phố Yên Bái trung tâm Chắnh trị - Kinh tế - Văn hoá của tỉnh 72 Km, cách thị xã Nghĩa Lộ 10 Km, cách Thủ ựô Hà Nội hơn 200 Km, có ựường quốc lộ 32 chạy dọc theo chiều dài của huyện, có các tuyến ựường thông thương với các huyện trong tỉnh là Trạm Tấu, Mù Cang Chải, Trấn Yên và các tỉnh bạn như Sơn La, Phú Thọ, Lai Châu tạo cho Văn Chấn có một hệ thống ựường bộ thuận tiện giao lưu với các huyện bạn trong tỉnh và các tỉnh bạn. Bên cạnh những thế mạnh trong phát triển kinh tế, Văn Chấn còn có vị trắ chiến lược quan trọng trong khu vực phòng thủ và hệ thống quốc phòng của tỉnh, của khu vực Tây Bắc.
Văn Chấn có ựịa hình phức tạp, có nhiều núi cao và suối lớn chia cắt. độ cao trung bình so với mặt nước biển 400 m. Huyện ựược chia thành 3 vùng lớn: Vùng trong (Vùng Mường Lò), vùng Ngoài và vùng cao thượng huyện.
- Vùng trong (vùng Mường Lò): Là vùng tương ựối bằng phẳng diện tắch tự nhiên là 13.185,07 ha chiếm 10,9% diện tắch toàn huyện. Là vùng có dân cư ựông ựúc, ựại bộ phận là người Kinh,Thái, Mường, tập quán canh tác chủ yếu là nông nghiệp. đây là vùng lúa trọng ựiểm của huyện và của tỉnh với diện tắch lúa tập trung gần 2.000 hạ
- Vùng ngoài: Có diện tắch tự nhiên là 56.096,37 ha chiếm 46,5% diện tắch toàn huyện. Vùng ngoài có mật ựộ dân cư thấp hơn vùng trong, ựại bộ phận là người Tày, Kinh có tập quán canh tác chủ yếu trồng cây lúa nước, cây công nghiệp chè và vườn rừng, ựời sống dân cư khá hơn so với toàn huyện.
- Vùng cao, thượng huyện: Là vùng có ựộ cao trung bình 600 m trở lên có diện tắch tự nhiên là 51.477,06 ha chiếm 42,6% diện tắch toàn huyện. Vùng này dân cư thưa thớt, tuy nhiên ựại bộ phận là ựồng bào thiểu số: Mông, Dao,