a) Chiết tách RNA
RNA của virus ựược tách chiết bằng Kit, quy trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất với các bước cụ thể như sau:
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer (AVL +AVE-carier RNA ựể dùng cho kit) (5.6 ml AVL + 56 ộl AVE- carier RNA cho 10 mẫu)
Bước 1: cho 560 ộl buffer vào ống eppendorff Bước 2: Thêm 140 ộl mẫu cần tách chiết
Bước 3: ly tâm ngắn
Bước 4: Ủ nhiệt ựộ phòng 10 phút Bước 5: Thêm 560 ộl cồn 96 - 1000
Votex 15 giây
Spin down loại bỏ các giọt trên nắp
Bước 6: Hút 630 ộl từ ống eppendorff vào cột QIA Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 7: Lặp lại bước 6 với phần dịch còn lại Bước 8: Thêm 500 ộl AW1
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 9: Thêm 500 ộl AW2
Ly tâm14.000 vòng/phút trong 3 phút Bỏ dịch trong phắa dưới
Bước 10: Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ hoàn toàn AW2
Bước 11: đặt cột QIA sang ống eppendorff sạch Thêm 60 ộl AVE
Ủ nhiệt ựộ phòng 1 phút
Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 1 phút Bước 12: Lặp lại bước 11 (nếu cần)
Thêm 30 ộl AVE vào cột QIA Ủ nhiệt ựộ phòng 1 phút
Tiếp tục ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút
Thu ựược 60 ộl dịch chiết RNA, bảo quản ở nhiệt ựộ -200C
b) Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ ựược hỗn hợp với các thành phần ựược trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tắch cần lấy (ộl)
2X Reaction Mix 12.5
Mẫu RNA 5
Primer Forwad 0.5
Primer Reverse 0.5
RT/Platium Taq Mix 0.5
Nước Deion 6
Tổng thể tắch 25 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Với trình tự mồi như sau:
Primer Forwad: GAG ACC ATG AGG TGG GCA AC Primer Reverse: CGC CAA AAG CAC CTT TTG T
Tiến hành phản ứng khuếch ựại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai ựoạn Bước tổng hợp Nhiệt ựộ (oC) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp cADN 50 30 phút 1 Duỗi mạch 95 5 phút 1 Duỗi mạch 95 15 giây Gắn mồi 50 30 giây 2 Tổng hợp sợi mới 72 1 phút 35 3 Hoàn chỉnh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
c) điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1.2%: Cân 1.2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, ựun sôi trong lò vi sóng, ựể nguội ựến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 ul Syber green, ựổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần ựiện dị
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2ộl loading dye vào 8 ộl sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể ựiện di: Chuyển thạch ựã ựông vào bể ựiện di, thêm TBE 1X ựến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR ựã trộn với loading dye vào các giếng với thể tắch 6ộl maker 100bp và 10ộl sản phẩm PCR mỗi giếng.
- điện di ở hiệu ựiện thế 100V trong 30 phút.
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN