Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến ựổi ựại thể cần tiến hành làm tiêu bản ựể xác ựịnh bệnh tắch vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu
bản vi thể theo quy trình tẩm ựúc bằng parafin, nhuộm Haematoxylin Ờ Eosin (HE) theo phương pháp của Bộ môn Bệnh lý Thú y, trường đại học Nông nghiệp Hà Nộị Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
- Khử formol.
+ Mục ựắch ựể rửa sạch formol.
+ Sau khi cố ựịnh bệnh phẩm trong dung dịch formol 10% từ 7 Ờ 10 ngày, lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành miếng tổ chức theo chiều dài có ựộ dài 4-5 mm. Sau ựó ựem rửa nước chảy nhẹ tối thiểu 24 giờ.
- Khử nước
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống nước thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho qua hệ thống gồm 4 lọ cồn. + Cồn 900I: 3 giờ. + Cồn 900II: 3 giờ. + Cồn 1000I: 4 giờ. + Cồn 1000II: 12 giờ. - Khử cồn
Lấy bệnh phẩm ra khỏi hệ thống cồn thấm nhẹ trên giấy lọc, rồi cho vào hệ thống 3 cốc ựựng xylen.
+ Xylen I: 4 giờ. + Xylen II: 4 giờ. + Xylen III: 12 giờ. - Khử xylen.
Cho qua hệ thống 3 cốc ựựng paraffin. + Paraffin I: 6 giờ (Ở 560C).
+ Paraffin II: 6 giờ (Ở 560C). + Paraffin IIỊ 12 giờ (Ở 560C).
- đúc Block.
+ đổ paraffin lỏng vào khuôn. Dùng kẹp hơ nóng nhúng nhanh vào ngăn ựể gắp miếng tổ chức ựặt vào khuôn.
+ Chừng 10 giây chất paraffin lỏng tiếp xúc với khuôn ựã tạo nên một màng mỏng và khi ựó bệnh phẩm ựã ựược ựịnh hướng. Sau ựó ựặt khuôn ựã ựúc sang bàn lạnh của máy làm nguội block.
+ Bóc khuôn, chỉnh sửa lại block cho vuông vắn và gắn nhãn tránh nhầm lẫn. - Cắt tiêu bản.
Cắt và dán mảnh: Cắt miếng tổ chức trên máy cắt microtom với ựộ dày 2 - 3ộm. Miếng tổ chức sau khi cắt ra sẽ ựược tãi phẳng trên phiến kắnh nhờ cho vào bình nước ấm. Chờ cho miếng tổ chức khô cho vào tủ ấm 370C trong 12 - 24 giờ. - Nhuộm tiêu bản
Nhuộm tiêu bản theo phương pháp nhuộm kép bằng thuốc nhuộm Hematoxylin-Eosin. Các bước nhuộm như sau:
+ Tẩy paraffin: Cho qua hệ thống 3 lọ xylen. Xylen I: 1h, Xylen II: 1h, Xylen III: 1h.
Sau ựó phải lau hết phần xylen quanh tiêu bản rồi chuyển sang cồn. + Tẩy Xylen: Cho tiêu bản qua hệ thống gồm hai lọ cồn ethylic.
Lọ 1: Cồn 1000 I: 10 phút, Lọ 2: Cồn 1000 II: 10 phút, Lọ 3: Cồn 1000: 10 phút.
+ Nhuộm Hematoxylin:
Sau khi ựã rửa tiêu bản qua nước chảy trong vòng 10 phút ta ựem lau khô nước xung quanh tiêu bản, ựặt tiêu bản lên trên giá ựể rồi nhỏ Hematoxylin ngập tiêu bản, ựể trong vòng 10 - 15 phút. Sau ựó ựổ thuốc nhuộm ựi, cho rửa nước chảy trong vòng 10 phút cho hết Hematoxylin thừạ đem lau sạch nước xung quanh tiêu bản và vẩy khô ựị Kiểm tra màu sắc, nêu thấy tiêu bản có màu xanh tắm là ựược. Nếu nhạt màu thì nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây). Nếu
ựậm quá thì nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 600 + HCl, tỷ lệ HCl là 1%) trong 30 giâỵ
+ Nhuộm Eosin:
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 10 phút tùy theo thực tế màu eosin. Sau ựó rửa nước chảy 10 phút cho hết eosin thừạ Sau khi rửa nước ta lau sạch phần nước xung quanh bệnh phẩm rồi cho vào nước cất ở lam kắnh.
+ Tẩy nước: Ta cho tiêu bản qua hệ thống Cồn 900I: 15 giâỵ
Cồn 1000I: 15 giâỵ Cồn 1000II: 15 giâỵ
+ Tẩy cồn làm trong tiêu bản: Cho tiêu bản qua xylen Ị Rồi sang xylen II, ta lau sạch cồn ở xung quanh lam kắnh rối chuyển sang xylen III rồi sang xylen IV, sau ựó cho vào xylen ựã làm nóng trong tủ ấm 370 trong vòng 2 phút.
- Gắn Baume canadạ
Nhỏ một giọt Baume canada, xylen ấm lên trên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen ấm lên trên tiêu bản. Ấn nhẹ ựể dồn hết bọt khắ ra ngoàị
- đánh giá kết quả.
đem soi kắnh hiển vi quang học với vật kắnh 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tắm, bào tương bắt màu ựỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khắ là ựược.