4. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.8. Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng Salmonella spp
spp phân lập đƣợc
Để kiểm tra vai trò gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được trên bản động vật, chúng tôi đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên lợn. Chúng tôi đã chọn 6 chủng vi khuẩn Salmonella, trong đó có 2 chủng S. choleraesuis, 2 chủng S. typhimurium và 2 chủng S. enteritidis. Các chủng này có thời gian giết chết chuột từ 8- 16 giờ, đều có khả năng xâm nhập và đều sản sinh độc tố. Đặc tính của các chủng này được trình bày ở bảng 14 a.
Bảng 14 a: Các chủng vi khuẩn Salmonella spp chọn gây bệnh
TT Kí hiệu chủng
Cơ quan
phân lập Địa điểm
Thời gian gây chết chuột (giờ) Yếu tố độc lực Stn InvA DT104 1 ĐT-S7 Gan Đại Từ 16 + + - 2 SC-S8 Lách Sông Công <8 + + - 3 SC-S1 Lách Sông Công 8-16 + + - 4 SC-S2 Gan Sông Công <8 + + - 5 ĐT-S17 Hạch ruột Đại Từ <8 + + - 6 PY-S18 Gan Phổ Yên 16 + + -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thí nghiệm được bố trí như sau: Chọn 14 lợn với tiêu chuẩn: Lợn 35 ngày tuổi, khỏe mạnh, có trọng lượng tương đương nhau, chưa tiêm vacxin phòng bệnh do Salmonella gây ra và âm tính với kháng thể kháng Salmonella. Tiến hành chia làm 2 lô: Lô thí nghiệm có 12 con và lô đối chứng 2 con. Ở lô thí nghiệm, lợn được tiêm đồng thời vào phúc xoang 6 ml và cho uống 10 ml canh trùng các chủng Salmonella tương ứng đã nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ (1 ml canh trùng ≈ 1x 109 vi khuẩn) . Mỗi chủng vi khuẩn gây bệnh cho 2 lợn. Lợn ở lô đối chứng được tiêm và cho uống môi trường nước thịt vô trùng với các liều tương tự. Theo dõi lợn hàng ngày sau khi gây bệnh. Kết quả thu được trình bày ở 14 b.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 14.b: Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi
Chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng Số lợn gây bệnh (con) Đƣờng gây bệnh Liều canh trùng (ml) Số lợn chết (con) Thời gian chết (giờ)
Triệu chứng sau gây bệnh Kết quả phân lập lạiVK
S. choleraesuis
ĐT-S7 2
Uống 10
2 28-32 Chết có vết bầm đỏ tím ở
rìa tai, chân, bụng, đuôi. S. choleraesuis Xoang
PM 6 SC-S8 2
Uống 10
2 48 Chết có vết bầm đỏ tím ở
rìa tai, chân, bụng, đuôi. S. choleraesuis Xoang PM 6 S. typhimurium SC-S1 2 Uống 10 2 48-72 Tiêu chảy nặng, chết. S. typhimurium Xoang PM 6 SC-S2 2 Uống 10
2 68-72 Tiêu chảy nặng, chết S. typhimurium Xoang
PM 6
S. enteritidis
ĐT-S17 2
Uống 10
2 60-72 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Xoang
PM 6 PY-S18 2
Uống 10
2 72-96 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Xoang
PM 6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đ/C 2 Uống 0 0 - Bình thường - Xoang PM 0
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả bảng 14.b cho thấy: Sau khi gây bệnh, tất cả lợn ở lô thí nghiệm (12/12 con) đều bị chết trong khoảng thời gian từ 28 - 96 giờ. Trong đó, cả 2 chủng vi khuẩn S. choleraesuis đều gây chết 100% lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 48 giờ. Điều này chứng tỏ các chủng S. choleraesuis này có độc lực rất cao, gây bệnh cho lợn ở thể cấp tính. Các triệu chứng lâm sàng trước khi lợn chết bao gồm: Cả 4 lợn đều sốt rất cao 42oC, toàn thân nổi mẩn đỏ, nhất là ở những vùng da mỏng như: Rìa tai, mõm, vùng bụng, lợn ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước...
Cả 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. typhimurium đều chết trong vòng 48-72 giờ. Tương tự, 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. enteritidis đều chết trong thời gian 60 - 96 giờ. Tất cả những lợn này đều bị tiêu chảy nặng sau 24 giờ gây bệnh.
Tất cả lợn chết đều được mổ khám kiểm tra bệnh tích (bảng 5), lấy chất chứa ruột non, hạch ruột, gan, lách, máu tim nuôi cấy trên các môi trường và đều phân lập lại được đúng loại vi khuẩn đã gây bệnh.
Bệnh tích của các lợn chết được mổ khám mà chúng tôi tổng hợp được cũng tương tự những mô tả về bệnh tích của tác giả Phan Thanh Phượng (1988) [35], Phạm Sỹ Lăng và cs (2004) [26].
4.9. Kết quả xác định hàm lƣợng kháng thể
* Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của lợn khi dùng auto vacxin chế từ các chủng Salmonella spp phân lập được
Vacxin là một chế phẩm sinh vật chứa tác nhân gây bệnh hoặc sản phẩm của nó nhưng đã được vô hoạt bằng formol, cũng có thể giảm độc lực bằng các phương pháp lý, hoá, sinh học nên không còn khả năng gây bệnh,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Khi đưa vacxin vào cơ thể thì có khả năng kích thích cơ thể thực hiện đáp ứng miễn dịch, hình thành kháng thể chủ động, giúp cho cơ thể con vật chống lại các tác nhân gây bệnh hay sản phẩm độc của chúng khi xâm nhập vào lần sau.
Ngày nay, biện pháp phòng bệnh bằng vacxin có thể coi là biện pháp khả thi nhất để khống chế các bệnh, trong đó có bệnh do Salmonella gây ra.
Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng vac xin Phó thương hàn của các công ty, xí nghiệp thuốc Thú y sản xuất. Chúng tôi thấy, vác xin Phó thương hàn đều dùng chủng S. choleraesuis, do đó có khả năng chỉ phòng được bệnh Phó thương hàn thể do chủng này gây ra cho lợn, chưa có tác dụng phòng được hội chứng tiêu chảy ở lợn do chủng S. enteritidis hay S. typhimunium
gây ra.
Vì vậy, sau quá trình giám định vi khuẩn tiến hành truớc đó, để đi đến kết luận các mẫu bệnh phẩm lấy ở lợn của tỉnh Thái Nguyên , bị tiêu chảy sắp chết do vi khuẩn Salmonella; chúng tôi sử dụng Autovacxin được chế tạo tại bộ môn Vi trùng Viện thú y với 3 chủng Salmonella: 01 chủng S.
choleraesuis, 01 chủng S. typhimurium và 01 chủng S. enterritidis phân lập được từ lợn mắc bệnh, có độc lực mạnh, cấu trúc kháng nguyên ổn định và mang đầy đủ các yếu tố gây bệnh. Autovacxin được chế dưới dạng vacxin vô hoạt, có bổ trợ keo phèn và sử dụng phương pháp lên men xục khí, do đó có số lượng kháng nguyên đạt trên 5 tỷ/ ml.
Theo P. Vannier và Laval A, tiêu chí để chọn một vacxin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Không được gây phản ứng toàn thân. Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất 24 giờ sau khi tiêm phòng.
- Ngăn cản hoặc làm giảm sự nhân lên của bệnh nguyên khi sơ nhiễm. - Ngăn không cho xảy ra bệnh hoặc làm giảm cường độ của nó sau khi nhiễm.
- Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài.
- Sử dụng và bảo quản dễ dàng và giá thành rẻ.
Chúng tôi tiến hành xác định hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm autovacxin được chế tại bộ môn Vi trùng Viện Thú y, để đánh giá khả năng gây miễn dịch của vacxin này.
Tiến hành chọn ra 6 lợn thí nghiệm với tiêu chuẩn: lợn ở lứa tuổi trên 1 tháng tuổi, khoẻ mạnh, có thể trạng tương đương nhau, chưa tiêm vacxin phòng bệnh do Salmonella gây ra. Cả 6 lợn thí nghiệm được lấy máu, chắt huyết thanh trước khi tiêm vacxin và sau khi tiêm vacxin tại các thời gian khác nhau để kiểm tra hiệu giá kháng thể. Sau đó chia ra: 2 lợn làm đối chứng không tiêm vacxin, 4 lợn còn lại sẽ được tiêm vacxin với liều 1ml/con. Sau 21 ngày lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể có trong cả 6 lợn. Kết quả thu được trình bày ở bảng 15.
Bảng 15: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể ở lợn sau khi đƣợc tiêm autovacxin chế từ các chủng Salmonella phân lập đƣợc
Đối tƣợng Ký hiệu Hiệu giá kháng thể
Mức độ ngƣng kết hồng cầu ở các hiệu giá khác nhau sau khi tiêm vacxin
Hiệu giá kháng thể
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiên cứu mẫu trƣớc khi tiêm vacxin 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 sau khi tiêm vacxin 21 ngày Lợn thí nghiệm S1 1/2 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1/64 S2 1/2 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1/128 S3 1/2 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1/64 S4 1/2 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 1+ 1/64 Lợn đối chứng ĐC1 1/2 1+ 1/2 ĐC2 1/2 1+ 1/2
Kết quả thí nghiệm ở bảng 15 cho thấy:
- Hiệu giá kháng thể của tất cả các lợn thí nghiệm và đối chứng với kháng nguyên Salmonella ở lợn trước khi tiêm vaccin là 1/2.
- 21 ngày sau tiêm vacxin, 100% số mẫu huyết thanh của lợn thí nghiệm đều có khả năng ngưng kết hồng cầu. Mức độ ngưng kết cũng giảm dần qua các mức hiệu giá khác nhau, mức độ hiệu giá càng cao thì mức độ ngưng kết càng giảm.
Hiệu giá kháng thể của những mẫu lấy từ lợn đã được tiêm vacxin rất cao (Mẫu S2 là 1/128; mẫu S1, S3 và S4 là 1/64) trong khi các mẫu đối chứng chỉ đạt hiệu giá kháng thể là 1/2.
Các mẫu huyết thanh của lợn đã được tiêm vacxin đều giữ mức độ ngưng kết 3+ cho đến tận hiệu giá 1/16
Đến hiệu giá 1/32 bắt đầu có sự khác biệt: chỉ có mẫu S2 đạt mức 3+ còn các mẫu S1, S3 và S4 giảm xuống mức 2+.
Ở hiệu giá 1/64 không có mẫu nào đạt mức 3+; mẫu S2 ngưng kết 2+ và các mẫu S1, S3, S4 ở mức 1+.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Ở hiệu giá 1/128 thì chỉ còn mẫu S2 ngưng kết, mức độ ngưng kết là 1+.
Kết quả trên cho thấy lượng kháng thể trong huyết thanh của lợn được tiêm autovacxin đã chế khá cao, chứng tỏ autovacxin gây được miễn dịch tốt. Qua kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của autovacxin được chế, có thể áp dụng vacxin này để phòng bệnh cho lợn do vi khuẩn Salmonella gây ra trong thực tiễn sản xuất.
4.10. Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm của các chủng Salmonella spp
phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh
Với sự tiến bộ mạnh mẽ của khoa học sinh học, hàng loạt các kháng sinh đã được phát hiện và sản xuất theo con đường sinh học và con đường tổng hợp hóa học. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh không đúng liều lượng, liệu trình và kết hợp nhiều loại kháng sinh đã đồng thời tạo nên áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác.
Cho đến nay, có rất nhiều bệnh nói chung và bệnh do vi khuẩn
Salmonella nói riêng, nhiều loại kháng sinh đã không còn tác dụng điều trị. Vì vậy trong chẩn đoán thường sử dụng phương pháp kháng sinh đồ để tìm loại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kháng sinh mẫn cảm phù hợp dùng điều trị, nhằm mục đích chữa bệnh đạt hiệu quả cao mà ít tốn kém, thay vì việc tự chọn một loại kháng sinh bất kỳ trong một lần điều trị, gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với kháng sinh.
Để có thể chọn được những kháng sinh có trên thị trường Thái Nguyên có tác dụng điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn do Salmonella. Trong phạm vi nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tôi xác định mức độ mẫn cảm với thuốc kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. Sử dụng 20 chủng Salmonella đã phân lập và chọn lọc, thử độ mẫn cảm với 11 loại kháng sinh, tiến hành và đánh giá theo phương pháp của Kirby - Bauer (1996). Các mẫu giấy kháng sinh do hãng OXOID sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 16.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 16: Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập đƣợc
TT Tên kháng sinh Số chủng kiểm tra Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 Neomycin 20 16 80,0 4 20,0 0 0,0 2 Spectinomycin 20 0 0,0 5 25,0 15 75,0 3 Amikacin 20 12 60,0 6 30,0 2 10,0 4 Ofloxacin 20 20 100,0 0 0,0 0 0,0 5 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole 20 0 0,0 0 0,0 20 100,0 6 Gentamycin 20 5 25,0 10 50,0 5 25,0 7 Norfloxacin 20 20 100,0 0 0,0 0 0,0 8 Cefuzoxime 20 5 25,0 9 45,0 6 30,0 9 Kanamycil 20 0 0,0 7 35,0 14 70,0 10 Cephazolin 20 2 10,0 2 10,0 16 80,0 11 Ciprofloxacin 20 18 90,0 2 10,0 0 0,0
Kết quả bảng 16 cho thấy: Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đều kháng hoàn toàn với Trimethoprime/Sulfamethoxazone (100%) và kháng cao với một số kháng sinh như: Cefazolin (80%) và Spectinomycin (75%). Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này. Như ở trên đã đề cập, do việc dùng các loại kháng sinh điều trị kéo dài, do sự có mặt thường xuyên của nhiều loại kháng sinh được bổ sung vào thức ăn và một nguyên nhân rất có thể xảy ra là hiện tượng di truyền dọc và di truyền ngang tính
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
kháng thuốc bởi các gen nằm trong Plasmid (Resistance) của các chủng vi khuẩn Salmonella.
Với 20 chủng Salmonella đã kiểm tra, thử kháng sinh đồ, vi khuẩn mẫn cảm nhất với Norfloxacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Neomycin (Tỷ lệ số chủng rất mẫn cảm và mẫn cảm trung bình chiếm 100%, không có chủng nào kháng thuốc), tiếp đến là Amikacin có 12/20 chủng (60%) mẫn cảm cao, 6/20 chủng mẫn cảm trung bình (30,00%), đã thấy 2 chủng (10%) kháng thuốc. Đối với Cefuzoxime có 5/20 chủng mẫn cảm cao (25%), 9/20 chủng mẫn cảm trung bình (45%), có tới 6/20 chủng kháng thuốc (30%). Cephazolin chỉ có 2/20 chủng mẫn cảm cao (25%), 2/20 chủng mẫn cảm trung bình (10%), có tới 16/20 chủng kháng thuốc (80%).
Không có chủng Salmonella nào trong 20 chủng thử kháng sinh đồ có mẫn cảm cao với Spectinomycin,Trimethoprime/Sulfamethoxazole, Cephazolin và
Kanamycin. Đã có tới 20/20 chủng (100%) kháng lại Trimethoprime/Sulfamethoxazole,
15/20 chủng (75%) kháng lại Spectinomycin; 80% (16/20 chủng) kháng thuốc
Cephazolin và 14 chủng chiếm 70,0% kháng lại Kanamycin.
Kết quả nghiên cứu của Phùng Quốc Chướng (2005) [7] cho biết: trong giai đoạn 1993 - 1995 mức độ kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella còn ít; giai đoạn 1996 - 1998 tỷ lệ các chủng Salmonella kháng thuốc có chiều hướng tăng lên.
Nhiều tác giả như Vũ Bình Minh và Cù Hữu Phú (1999) [29], Tô Liên Thu (2004) [42], Đỗ trung Cứ và cộng sự (2001) [8] khi xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đều khẳng định: nhiều loại kháng sinh thông thường như: Streptomycin,
Ampicillin… bị vi khuẩn Salmonella kháng lại, với tỷ lệ số chủng đã thử chiếm tỷ lệ cao.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sự mẫn cảm với thuốc kháng sinh và hoá dược của vi khuẩn
Salmonella luôn thay đổi; khác nhau ở từng loại vật nuôi, ở từng cá thể…Do vậy, việc so sánh kết quả kháng sinh đồ trong nghiên cứu của tác giả này với kết quả nghiên cứu của tác giả khác cũng chỉ có ý nghĩa tham khảo.
Cũng như nhiều nơi, tại Thái Nguyên, việc dùng kháng sinh trong chăn