3. Đối tƣợng, nguyên liệu, nội dung và phƣơng pháp nghiêu cứu
3.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
3.3.1. Mẫu bệnh phẩm
- Mẫu bệnh phẩm là Phủ tạng gồm: gan, lách, hạch ruột, ruột non, ruột già, máu tim của lợn dưới 3 tháng tuổi bị tiêu chảy vừa chết hay sắp chết.
- Mẫu phân lợn tiêu chảy và lợn khỏe được lấy bằng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng.
3.3.2. Các loại hoá chất, môi trường
* Các loại môi trường
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là những loại môi trường (của các hãng: Eiken, Oxoid, Biorad,...) ở dạng tổng hợp, khi dùng pha theo công thức có sẵn bao gồm:
- Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM
Salmonella và thạch DHL dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella - Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng để giám định vi khuẩn Salmonella
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn
* Các loại hóa chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sucroze, Galactoze, Manitol, Arabinoze.
- Thuốc nhuộm Gram, dung dịch Kovac’s, dung dịch Andrader - Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
3.3.2.1. Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn Salmonella
Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn
Salmonella
3.3.2.2 Các loại hóa chất, Primer và chủng vi khuẩn dùng cho phản ứng PCR
- Gồm Primer, Taq-DNA polymerase, dNTPs, đệm phản ứng, đệm điện di TAE (Tris-Acetic-EDTA), nhuộm điện di (Gel loading buffer), nhuộm DNA (Ethidium Bromide).
- Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương gồm: S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp.
- Các loại môi trường dùng cho nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn đường ruột bao gồm: thạch máu, thạch MacConkey, thạch TST, thạch DHL, thạch Brilliant Green, nước thịt BHI, nước thịt thường, nước thịt Pepton, thạch Simmons critrate và các loại môi trường đường Glucose, lactoze Mannitol ... do hãng OXID của Anh sản xuất.
- Giấy tẩm kháng sinh do hãng OXID của Anh sản xuất.
- Kháng huyết thanh chuẩn đơn giá và đa giá do Nhật Bản cung cấp.
- Các chủng vi khuẩn Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidischuẩn do Nhật Bản cung cấp.
3.3.3. Động vật thí nghiệm
- Chuột bạch: 18 - 20g khỏe mạnh.
- Lợn 35 ngày tuổi khỏe mạnh chưa sử dụng vacxin Salmonella tiêm phòng để gây bệnh thực nghiệm với vi khuẩn Salmonella phân lập được.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ
Sử dụng phương pháp dịch tễ học mô tả (Desciptive study) dịch tễ học phân tích (Analytical study), và dịch tễ học thực nghiệm ( Nguyễn Như Thanh (2001) [40], Nguyễn Văn Thiện (1997) [45] ).
3.4.1.1. Chọn mẫu điều tra
Dùng phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc, điều tra lấy ngẫu nhiên mỗi huyện 3 - 5 xã, mỗi xã 3 - 5 thôn có các hộ chăn nuôi lợn.
- Số lần được điều tra: 4 lần theo các mùa trong năm - Số hộ: 1120 hộ
- Số lợn được điều tra: 8.565 con
3.4.1.2. Phương pháp tính tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết
- Số lợn mắc tiêu chảy và chết do tiêu chảy tại các hộ, các trang trại chăn nuôi.
- Các triệu chứng thường gặp ở lợn mắc tiêu chảy.
- Các bệnh tích ở lợn mắc tiêu chảy khi tiến hành mổ khám, lấy mẫu bệnh phẩm.
3.4.1.4. Các phương pháp đo lường trong dịch tễ
Số lợn tiêu chảy
Tỷ lệ lợn tiêu chảy (%) = ––––––––––––––––––––––– x 100 Tổng số lợn điều tra
Tỷ lệ lợn tiêu chảy theo độ tuổi (%) =
Số lợn tiêu chảy theo từng độ tuổi
x 100 –––––––––––––––––––––––––––––
Tổng số lợn điều tra ở độ tuổi đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tỷ lệ lợn chết do tiêu chảy (%) ––––––––––––––––––––––––––––– Tổng số lợn tiêu chảy Tỷ lệ lợn khỏi bệnh (%) = Số lợn điều trị khỏi x 100 ––––––––––––––––––––––––––––– Tổng số lợn điều trị
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.2. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào trực tràng lợn từ sơ sinh đến 3 tháng tuổi bị tiêu chảy, cho vào các type vô trùng, đạy nút. Ghi số hiệu và các thông tin như tên chủ hộ, ngày lấy mẫu, loại lợn, tuổi... bảo quản trong phích đá và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
- Mẫu bệnh phẩm như gan, lách, hạch màng treo ruột, chất chứa trong ruột non,... từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy sắp chết hoặc chết nghi bệnh phó thương hàn; mổ khám tại chỗ, lấy bệnh phẩm, bảo quản mẫu trong phích đá vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm và tiến hành xét nghiệm ngay; các mẫu chưa thực hiện xét nghiệm, được bảo quản lạnh 0 - 40C, nhưng không quá 24 giờ kể từ lúc thu thập. Mỗi loại bệnh phẩm được chứa riêng rẽ, ghi rõ số mẫu, địa chỉ, lứa tuổi lợn,...
3.4.3. Phân lập và giám định vi khuẩn
- Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y.
Sơ đồ 3.1 trình bày tóm tắt quy trình phân lập và giám định vi khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sơ đồ 3.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella
Bệnh phẩm
(Phân, máu tim, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột)
BPW (370C/ 18- 24 h) LIM (370C/ 20- 24 h) (37Malonate 0 C/ 18- 24 h) TSI (370C/ 18- 24 h) Xác định serotyp Giữ giống RV (420C/ 18- 24 h) DHL (370C/ 20- 24 h) CHROM TM Salmonella (370C/ 20- 24 h)
Phản ứng lên men đường
Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh Xác định các yếu tố độc lực MacConKey
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
từ các mẫu phân và phủ tạng
3.4.4 Phương pháp giám định vi khuẩn Salmonella spp phân lập được
3.4.4.1. Kiểm tra tính chất mọc trên các môi trường thông thường và đặc hiệu
Kiểm tra các môi trường nước thịt, môi trường thạch thường, môi trường thạch MacConKey, môi trường thạch DHL, môi trường thạch TSI về tính chất mọc của Salmonella.
3.4.4.2. Kiểm tra hình thái học 3.4.4.3. Kiểm tra di động
Kiểm tra di động bằng phương pháp giọt treo
3.4.5. Phương pháp giám định các đặc tính sinh hoá
3.4.6. Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được
Xác định serotyp của các chủng Salmonella phân lập được bằng các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm bằng kháng huyết thanh chuẩn (hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo, Nhật Bản) đối với kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H. Trên cơ sở kết quả thu được, tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra dựa vào bảng phân loại Kauffmann và White.
3.4.6.1. Xác định nhóm kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đa giá nhóm O
Sử dụng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Rapid Slide Aglutination) để xác định nhóm kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella. Đây là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể được sử dụng rất phổ biến trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán và giám định các loại vi khuẩn.
- Chuẩn bị:
+ Khuẩn lạc vi khuẩn được nuôi cấy vào thạch TSI hoặc thạch thường để tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Kháng huyết thanh chuẩn đa giá. - Tiến hành:
+ Chia 1 phiến kính sạch làm 2 phần: 1 phần làm đối chứng, và 1 phần làm thí nghiệm. Nhỏ vào mỗi bên phiếm kính một giọt nước sinh lý.
+ Lấy một ít khuẩn lạc Salmonella cần định typ đã được cấy trên thạch TSI hoặc thạch thường, hòa với mỗi giọt nước muối sinh lý đã nhỏ sẵn ở hai bên phiến kính thành huyễn dịch kháng nguyên.
+ Nhỏ tiếp vào bên thí nghiệm 1 giọt kháng huyết thanh đa giá nhóm O, còn bên đối chứng âm, nhỏ thêm một giọt nước muối sinh lý. Trộn đều, lắc nhẹ phiến kính trong khoảng 30 - 60 giây.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính khi có cụm ngưng kết kiểu hạt xuất hiện, huyễn dịch xung quanh trong. Bên đối chứng âm huyễn dịch vẫn đục đều.
3.4.6.2 Xác định kháng nguyên O bằng kháng huyết thanh đơn giá nhóm O
Các chủng cho kết quả dương tính với kháng huyết thanh O đa giá, tiếp tục được xác định với các kháng huyết thanh đơn giá. Cách làm tương tự như phương pháp đã được trình bày ở phần 3.4.6.1.
3.4.6.3. Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella
Sau khi đã xác định kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella, tiếp tục tiến hành xác định kháng nguyên H của chúng.
3.4.6.3.1 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 1)
- Chuẩn bị:
+ Các chủng vi khuẩn Salmonella cần định typ được cấy trên môi trường thạch TSI hoặc thạch thường, ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ.
+ Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ, cấy vào môi trường nước BHI (5ml) để tủ ấm 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau đó, thêm vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
canh trùng 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước sinh lý + 1% Formalin) nhằm mục đích là để cố định kháng nguyên H.
+ Kháng huyết thanh nhóm H gồm: Ha, Hb, Hc, Hd, He,h, HG, Hi, Hk, HL, Hr, Hy, He,n, H1
- Tiến hành:
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh từ Ha đến H1 vào mỗi ống nghiệm. + Dùng Micropipet, hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhiệt độ 50oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây, các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều.
3.4.6.3.2 Xác định kháng nguyên H của vi khuẩn Salmonella (pha 2)
Sau khi có kết quả xác định kháng nguyên H pha 1 của các chủng
Salmonella, chúng tôi tiến hành xác định tiếp kháng nguyên H pha 2 của chúng.
+ Hút 3,5 ml môi trường nước thịt HI hoặc BHI có chứa 0.25% thạch vào trong 1 ống nghiệm có nút vặn, có chứa sẵn 1 ống thủy tinh nhỏ hở 2 đầu.
+ Để ống nghiệm đó vào bể ủ nhiệt ở 50oC trong 15 phút, sau đó nhỏ 50 µl kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của pha 1 vào ống nghiệm.
+ Dùng que cấy thẳng, lấy 1 khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần định typ, cấy thẳng vào phía trong của ống thủy tinh nhỏ sâu khoảng 1-1,5cm. Sau đó ủ ở tủ ấm 37oC trong vòng 24 giờ.
+ Lấy 1 vòng que cấy của chủng vi khuẩn đã phát triển trong môi trường (chủng này có thể di chuyển qua thạch mà không bị ức chế), cấy vào 1 ống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
nghiệm có chứa 5 ml BHI, để nghiêng týp trong tủ ấm 37oC trong vòng 6 giờ. + Thêm vào đó 5 ml dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung Formalin (nước muối sinh lý + 1% Formalin), để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ.
+ Nhỏ 2 giọt kháng huyết thanh tương ứng với kết quả của các chủng tạo pha 2 vào mỗi ống nghiệm.
+ Dùng Micropipet hút 450 µl canh trùng Salmonella đã sử lý ở trên và cho vào ống nghiệm đã có chứa kháng huyết thanh.
+ Lắc nhẹ để trộn đều canh trùng và kháng huyết thanh trong ống nghiệm, sau đó đặt vào bể ủ nhiệt ở nhệt độ 50oC trong 1 giờ.
+ Đọc kết quả: Phản ứng dương tính thì có ngưng kết kiểu đám mây, các cụm ngưng kết tương đối lỏng lẻo. Phản ứng âm tính thì dung dịch trong ống nghiệm đục đều.
3.4.7. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh
Sử dụng phương pháp của Kirby- Bauer và đánh giá kết quả thử khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với các loại kháng sinh dựa vào bảng đánh giá kết quả của NCCLS (2000) (Các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm của Hội đồng quốc gia Mỹ - National committee for Clinical Laboratory Standards) [70].
Bảng 3.1: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh
TT Loại kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc 1 Amikacin 30 µg ≥ 17 15 - 16 ≤ 14 2 Amoxicillin 20 µg ≥ 20 - ≤ 19
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TT Loại kháng sinh Hàm lƣợng Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc 3 Ampicillin 10 µg ≥ 22 12 - 22 ≤ 11 4 Cefotaxime sodium 30 µg ≥ 24 - ≤ 24 5 Ceftazidine 30 µg ≥ 20 15 - 19 ≤ 14 6 Ciprofloxacin 5 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 7 Colistin 10 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 8 Kanamycin 30 µg ≥ 18 14 - 17 ≤ 13 9 Erythromycin 15 µg ≥ 21 16 - 20 ≤ 15 10 Gentamycin 10 µg ≥ 13 - ≤ 12 11 Lincomycin 15 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 12 Neomycin 30 µg ≥ 15 13 - 14 ≤ 12 13 Ofloxacin 5 µg ≥ 16 13 - 15 ≤ 12 14 Rifampicin 30 µg ≥ 20 17 - 19 ≤ 16 15 Tetracycline 30 µg ≥ 23 19 - 22 ≤ 18 16 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole 25 µg ≥ 16 11 - 15 ≤ 10
3.4.8. Phương pháp xác định một số yếu tố gây bệnh (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
* Tách DNA
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 - 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vô trùng. Đun cách thủy ở 100o
C trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa DNA để làm phản ứng PCR.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104 (definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả: Suzuki và cs, 1994 [72]; Pritchett và cs, 2000 [66]; Saitoh và cs, 2005 [69]; Cloeckaert và cs, 2006 [54]; Cortez và cs, 2006 [55]; Skyberg và cs, 2006 [71].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.2: Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập đƣợc
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp)
Stn- F Stn- R 5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’ 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3’ 259 InvA- F InvA- R 5’- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3’ 5’- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3’ 521 104SR- F 104SR-R 5’- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3’ 5’- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3’ 162 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần: - 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP].
- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
- 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene). - Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50o
C/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72o
C/ 7 phút. * Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm
TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút. * Nhuộm:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vòng 15 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng DNA được so với DNA chuẩn