2. Mục đích và ý nghĩa của đề tài
2.3.3. Nghiên cứu biện pháp phòng và trị bệnh
- Xác định hiệu lực của 3 phác đồ điều trị bệnh Leucocytozoon cho gà - Độ an toàn của 3 phác đồ điều trị bệnh Leucocytozoon đối với gà
2.4. Bố trí thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.4.1.1. Phương pháp bố trí thu thập dĩn
Chúng tôi đã thu thập đƣợc 80 cá thể dĩn tại 4 huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên. Cụ thể nhƣ sau:
Địa phƣơng (huyện, thị) Số lƣợng dĩn (con) Dụng cụ bắt dĩn
H. Phổ Yên 20
Vợt làm bằng túi nilon trong suốt
TX. Sông Công 20
H. Đồng Hỷ 20
H. Võ Nhai 20
2.4.1.2. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ nhiễm Leucocytozoon của gà ở các địa phương
Chúng tôi đã thu thập đƣợc 1002 mẫu máu tại 4 huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên theo phƣơng pháp chùm nhiều bậc.
Cụ thể nhƣ sau:
- Huyện Phổ Yên: 257 mẫu máu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Huyện Đồng Hỷ: 249 mẫu máu
- Huyện Võ Nhai: 234 mẫu máu
2.4.1.3. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ nhiễm Leucocytozoon theo địa hình
Căn cứ vào bản đồ địa lý của tỉnh Thái Nguyên để phân các địa phƣơng nghiên cứu thành 3 loại địa hình.
Số lƣợng mẫu thu thập mẫu cụ thể nhƣ sau:
- Vùng núi cao: 391 mẫu
- Vùng trung du: 343 mẫu
- Vùng đồng bằng: 268 mẫu
2.4.1.4. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ và cường độ nhiễm theo mùa vụ
Chung tôi đã thu thập mẫu máu gà ở 4 mùa trong năm tại 4 huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên. Cụ thể:
- Vụ Xuân (từ tháng 2 - tháng 4): 244 mẫu
- Vụ Hè (từ tháng 5 - tháng 7): 263 mẫu
- Vụ Thu (từ tháng 8 - tháng 10): 237 mẫu
- Vụ Đông (từ tháng 11 - tháng 1 năm sau): 258 mẫu
2.4.1.5. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở gà theo phương thức chăn nuôi
Chúng tôi đã thu thập máu của gà đƣợc nuôi theo 3 phƣơng thức sau:
- Chăn thả hoàn toàn: 274 mẫu
- Bán chăn thả : 387 mẫu
- Nuôi nhốt: 341 mẫu
2.4.1.6. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo loại gà
Chúng tôi đã thu thập máu gà theo 3 loại gà: Gà địa phƣơng, gà lai và gà ngoại. Số lƣợng mẫu thu thập cụ thể nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Gà lai: 345 mẫu
- Gà ngoại: 340 mẫu
2.4.1.7. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo tuổi gà
Chúng tôi đã thu thập mẫu máu của gà ở 5 lứa tuổi. Số lƣợng mẫu thu thập cụ thể nhƣ sau: ≤ 1 tháng tuổi: 125 mẫu > 1 – 2 tháng tuổi: 228 mẫu > 2 – 4 tháng tuổi: 231 mẫu > 4 – 6 tháng tuổi: 185 mẫu > 6 tháng tuổi: 206 mẫu
2.4.1.8. Phương pháp bố trí theo dõi 4 tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo tính biệt gà
Kết quả thu thập cụ thể nhƣ sau:
- Gà trống: 478 mẫu
- Gà mái: 524 mẫu
2.4.1.9. Phương pháp bố trí theo dõi tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo tình trạng vệ sinh thú y
Chúng tôi thu thập mẫu máu gà tại các địa phƣơng theo các tình trạng VSTY trong chăn nuôi gà.
Tình trạng VSTY đƣợc phân ra ba mức nhƣ sau:
- VSTY tốt: chuồng trại cao ráo, thoáng mát, sạch sẽ, thƣờng xuyên quét dọn chuồng nuôi và khu vực xung quanh chuồng nuôi, thu gom phân và chất độn chuồng để ủ, định kỳ khử trùng, tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, phát quang cây cỏ, khơi thông cống rãnh.
- VSTY trung bình: không thƣờng xuyên quét dọn chuồng nuôi và khu vực xung quanh chuồng nuôi, chuồng nuôi không đƣợc làm khô ráo, còn có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
những vũng nƣớc đọng; không thƣờng xuyên tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và phát quang cây cỏ; không thƣờng xuyên khơi thông cống rãnh ở gần khu vực chăn nuôi.
- VSTY kém: chuồng gà làm ở chỗ đất trũng, trong chuồng và khu vực xung quanh chuồng rất ẩm thấp, có nhiều vũng nƣớc đọng, có nhiều cỏ cây lúp xúp, không tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, không khơi thông cống rãnh.
Bố trí thu thập mẫu máu gà nhƣ sau:
- Tình trạng VSTY tốt : 317 mẫu
- Tình trạng VSTY trung bình : 351 mẫu
- Tình trạng VSTY kém : 334 mẫu
2.4.1.10. Phương pháp bố trí theo dõi xác định loài Leucocytozoon ký sinh ở gà tại thái Nguyên
Các tiêu bản máu sau khi xét nghiệm thấy có đơn bào đƣờng máu ký sinh, chúng tôi tiến hành phân loại theo căn cứ vào hình thái, kích thƣớc, của các loại đơn bào đã phát hiện đƣợc theo khóa định loại của Levine N. D. (1985) [35].
2.4.1.11. Phương pháp bố trí theo dõi triệu chứng lâm sàng bệnh Leucocytozoon ở gà
Chúng tôi đã bố trí theo dõi triệu chứng lâm sàng của 197 gà nhiễm đơn bào Leucocytozoon (197 gà này có kết quả xét nghiệm máu phát hiện thấy Leucocytozoon trong hồng cầu).
2.4.1.12. Phương pháp bố trí theo dõi chỉ số máu của gà bị bệnh và gà khỏe
Gà sau khi đƣợc xác định là nhiễm đơn bào Leucocytozoon với cƣờng độ nặng, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu, xét nghiệm để xác định sự thay đổi các chỉ tiêu huyết học so với gà khỏe. Tiến hành 2 đợt thí
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
nghiệm, mỗi đợt gồm 16 mẫu, trong đó có 8 mẫu máu của gà bị bệnh
Leucocytozoon và 8 mẫu máu của gà khỏe.
Đợt thí nghiệm Số mẫu máu gà khỏe Số mẫu máu gà bệnh Chỉ số máu xác định I 8 8 - Số lƣợng hồng cầu - Số lƣợng bạch cầu - Số lƣợng tiểu cầu - Hàm lƣợng huyết sắc tố - Công thức bạch cầu II 8 8
2.4.1.13. Phương pháp bố trí theo dõi bệnh tích đại thể của gà mắc bệnh Leucocytozoon và tỷ lệ các cơ quan có đơn bào ký sinh
Chúng tôi tiến hành mổ khám 37 gà nhiễm Leucocytozoon ở cƣờng độ
trung bình và nặng, quan sát bệnh tích đại thể ở các cơ quan, tổ chức gà bệnh. Chụp ảnh vùng bệnh tích điển hình.
Lấy các cơ quan có bệnh tích điển hình, cắt lát, áp phiến kính, soi dƣới kính hiển vi tìm đơn bào Leucocytozoon.
2.4.1.14. Phương pháp bố trí theo dõi hiệu quả và độ an toàn của 3 phác đồ điều trị bệnh Leucocytozoon cho gà.
Chúng tôi đã bố trí thí nghiệm trên 115 gà nhiễm đơn bào
Leucocytozoon ở các cƣờng độ nhiễm khác nhau. Trƣớc khi dùng thuốc, xác định cƣờng độ nhiễm bằng cách đếm số đơn bào/ vi trƣờng. Sau 10 ngày dùng thuốc, kiểm tra lại máu của những gà đó để xác định hiệu lực của thuốc.
Độ an toàn của thuốc đƣợc đánh giá bằng cách: theo dõi các trạng thái sinh lý của gà trong vòng 5 giờ sau dùng thuốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn Phác đồ Thuốc sử dụng Số gà điều trị (con) Liệu trình (ngày) Thời gian xét nghiệm máu sau dùng thuốc 1 - Monosulfa 200 W.S - Marphasol – thảo dƣợc 46 5 10 ngày 2 - RTD - coccistop - Marphasol – thảo dƣợc 37 5 10 ngày 3 - Marcoc - Marphasol – thảo dƣợc 32 5 10 ngày
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2.1. Phương pháp xác định sự phân bố dĩn – KCTG của đơn bào Leucocytozoon ở các địa phương
Mẫu dĩn đƣợc thu thập từ một số địa phƣơng của 4 huyện, thị. Dùng vợt làm bằng túi nilon trong suốt để bắt dĩn Để dĩn chết tự nhiên, sau đó sấy khô.
Bảo quản riêng số dĩn thu thập ở mỗi huyện, thị trong một lọ tiêu bản có đánh số thứ tự.
Phân loại dĩn theo khoá định loài của Gosevic A. B. (1973); Eldridge B. F., Edman J. D. (2004) [31], tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng căn cứ vào đặc điểm về hình thái cấu tạo của gân cánh, vòi hút, số lƣợng chân, số lƣợng cánh.
2.4.2.2. Phương thu thập mẫu máu và làm tiêu bản * Phương pháp thu thập mẫu máu
Thu thập máu gà ở 4 huyện thị của tỉnh Thái Nguyên, gồm: huyện Phổ Yên, huyện Đồng Hỷ, huyện Võ Nhai và thị xã Sông Công.
Mẫu đƣợc thu thập ngẫu nhiên tại các nông hộ, các trại chăn nuôi gà tại các xã của 4 huyện, thị nói trên.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phương pháp phiết kính máu
Chuẩn bị những phiến kính mới đã đƣợc tẩy mỡ bằng cách rửa xà phòng, sau đó ngâm trong cồn 960
trong 3 giờ rồi lau khô bằng khăn mềm không có xơ. Đồng thời, chọn những lamen kích thƣớc 2 x 2 cm, rìa thật phẳng và nhẵn.
Trƣớc khi lấy mẫu máu xét nghiệm, quan sát kỹ các biểu hiện lâm sàng của gà. Dùng kim lấy 1 giọt máu tƣơi của gà tại tĩnh mạch cánh, đặt lên phiến kính, cách bờ phiến kính khoảng 1 cm. Đặt cạnh của một lamen lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính. Khi giọt máu đã dàn ra khắp cạnh của lamen thì đẩy lá kính về phía trƣớc, làm cho máu đƣợc dàn thành một lớp mỏng và đều trên phiến kính. Cố định tiêu bản bằng cồn methanol. Tiêu bản đƣợc đánh số thứ tự bằng bút chì mỡ. Mỗi gà làm 10 tiêu bản máu. Ghi nhật ký thí nghiệm các thông tin: chủ hộ, địa chỉ, ngày lấy mẫu, giống gà, tuổi gà, phƣơng thức chăn nuôi, tính biệt, trạng thái và màu sắc phân, điều kiện VSTY trong chăn nuôi, các biểu hiện lâm sàng (nếu có).
* Chuẩn bị thuốc nhuộm giemsa cơ bản
Theo Phan Lục (2006) [18], dung dịch giemsa cơ bản gồm: - Giemsa bột: 3,8 g
- Cồn etylic tuyệt đối: 375 ml - Glycerin: 125 ml
Dùng đũa thủy tinh khuấy kỹ rồi để vào tủ ấm 370C với thời gian 48 h, sau đó lọc qua giấy lọc, bỏ cặn và bảo quản trong lọ thủy tinh màu trung tính, có nút kín.
* Phương pháp nhuộm giemsa tiêu bản máu
Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2008) [10] cho biết: nhuộm tiêu bản máu bằng thuốc nhuộm giemsa gồm 3 bƣớc sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
+ Giemsa cơ bản: 1 phần
+ Nƣớc cất trung tính (pH = 7,2): 9 phần
Nƣớc cất để sẵn trong 1 cốc nhỏ có mỏ (100 ml), lấy dung dịch giemsa cơ bản bằng 1 pipet, nhỏ chậm giemsa vào cốc nƣớc, không đƣợc lắc cốc trong khi nhỏ giemsa vào cốc.
Bƣớc 2: Đổ chậm dung dịch nhuộm vào hộp nhuộm cho ngập các tiêu bản, đậy nắp hộp nhuộm để tránh bụi.
Thời gian nhuộm: 40 - 50 phút. Bƣớc 3: Lấy tiêu bản
Dùng 1 pince kẹp, cặp và lấy lần lƣợt từng tiêu bản, rửa sạch tiêu bản dƣới vòi nƣớc cất (pH = 7,2). Sau đó dựng nghiêng tiêu bản, để khô tự nhiên.
Kiểm tra dƣới kính hiển vi với vật kính dầu, độ phóng đại x 1000 lần. Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2005) [13]: việc chẩn đoán bằng phƣơng pháp làm tiêu bản máu, nhuộm giemsa có thể phát hiện trên 95% ca bệnh
Leucocytozoon ở gà.
* Phương pháp lấy mẫu máu để xác định một số chỉ số máu
Lấy mẫu máu gà khoẻ và gà bị bệnh Leucocytozoon ở tĩnh mạch cánh,
mỗi gà lấy 1 ml máu, cho vào ống nghiệm có tráng chất chống đông máu. Đánh số thứ tự và ghi các thông tin cần thiết. Các mẫu máu đƣợc xét nghiệm ngay trong ngày.
* Phương pháp kiểm tra tìm Leucocytozoon trên tiêu bản nhuộm
Nhỏ 1 giọt dầu Bạch dƣơng lên tiêu bản, kiểm tra tiêu bản dƣới kính hiển vi bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1000 lần.
Những mẫu máu tìm thấy đơn bào Leucocytozoon đƣợc xác định là có
nhiễm, ngƣợc lại là không nhiễm.
Cƣờng độ nhiễm đƣợc xác định bằng cách đếm số đơn bào
Leucocytozoon trên 3 vi trƣờng kính hiển vi, tính trung bình và quy định theo các cƣờng độ: nhẹ, trung bình và nặng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 - 2 đơn bào trên vi trƣờng: nhiễm nhẹ (+)
3 - 5 đơn bào trên vi trƣờng: nhiễm trung bình (++) > 5 đơn bào trên vi trƣờng: nhiễm nặng (+++)
2.4.2.3. Phương pháp Định loài Leucocytozoon ký sinh ở gà tại Thái Nguyên
Định loại căn cứ vào hình thái, kích thƣớc Leucocytozoon trƣởng thành theo khoá định loài của Levine N. D. (1985) [37]; Martinsen E. S. và cs (2006)
2.4.2.4. Phương pháp xác định đặc điểm bệnh lý và lâm sàng bệnh Leucocytozoon ở gà
* Xác định những biến đổi lâm sàng của gà bằng cách quan sát mào, yếm, thể trạng, phân, ăn uống, vận động...
* Xác định một số chỉ số máu (số lƣợng hồng cầu, số lƣợng bạch cầu, số lƣợng tiểu cầu, hàm lƣợng huyết sắc tố và công thức bạch cầu) của gà khỏe và gà mắc bệnh Leucocytozoon bằng máy Osmetech OPTI - CCA/ Blood GasAnalfzen tại Bệnh viện Đa khoa Trung ƣơng - Thái Nguyên.
Nội dung này đƣợc theo dõi lặp lại 2 lần.
* Mổ khám theo phƣơng pháp mổ khám toàn diện của Skrjabin K. I. (1928) để xác định những biến đổi đại thể ở các phủ tạng và cơ do đơn bào
Leucocytozoon gây ra.
Mổ khám những gà có triệu chứng của bệnh và khi xét nghiệm máu có
đơn bào Leucocytozoon trong máu. Quan sát bằng mắt thƣờng và kính lúp cơ
và các nội quan nhƣ thận, lách, tim, phổi, ruột...Ghi nhật ký thí nghiệm kết quả biến đổi của gà mổ khám. Soi tƣơi tiêu bản làm từ các cơ quan để kiểm tra xem có đơn bào Leucocytozoon ký sinh hay không.
Chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình.
2.2.2.5. Xác định hiệu lực và độ an toàn của 3 phác đồ sử dụng điều trị bệnh Leucocytozoon cho gà ở Thái Nguyên
Xác định hiệu lực của 3 phác đồ: Sử dụng 3 phác đồ đã trình bày ở mục 2.4.1.14 để điều trị cho những gà bị bệnh Leucocytozoon. Sau khi cho gà sử dụng 10 ngày, xét nghiệm lại máu của những gà đã đƣợc dùng thuốc bằng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
phƣơng pháp dàn tiêu bản máu và nhuộm giemsa. Nếu không tìm thấy đơn bào Leucocytozoon trong máu thì đánh giá thuốc có hiệu lực triệt để với
Leucocytozoon, nếu vẫn thấy đơn bào Leucocytozoon trong máu nhƣng cƣờng độ nhiễm giảm rõ rệt thì đánh giá thuốc có hiệu lực với Leucocytozoon nhƣng chƣa triệt để. Nếu cƣờng độ nhiễm Leucocytozoon vẫn không giảm so với trƣớc khi dùng thuốc hoặc giảm không đáng kể thì đánh giá thuốc không có hiệu lực với Leucocytozoon.
Xác định độ an toàn của thuốc: Tiến hành theo dõi các trạng thái cơ thể, các phản ứng của gà trƣớc và sau khi dùng thuốc. Các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu gồm: ăn uống, vận động, màu sắc của mào, yếm và các phản ứng phụ khác.
2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê sinh học theo tài liệu của Nguyễn Văn Thiện (2008) [24].
* Đối với các tính trạng định tính như tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm Leucocytozoon được tính theo công thức:
- Số trung bình cộng:
P =
m n
Trong đó: m: Số gà nhiễm đơn bào Leucocytozoon
n : Tổng số gà lấy mẫu máu xét nghiệm
- Sai số của số trung bình mq= mp= ± n q p. = ± n q p(1 ) Trong đó: mp và mq : Sai số của p và q
p và q : Tỷ lệ % gà nhiễm và không nhiễm Leucocytozoon
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Đối với các tính trạng định lượng như số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố... được tính theo công thức:
- Số trung bình cộng n X X n i i 1
- Sai số của số trung bình:
1 n x S mX (n ≤ 30) - Độ lệch tiêu chuẩn: 1 2 1 1 2 n n X X x S n i i n i i (n ≤ 30) Trong đó: X : Số trung bình n : Dung lƣợng mẫu X
m : Sai số của số trung bình x