2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
2.2.3.Thử nghiệm thuốc tẩy sán dây cho chó và đề xuất biện pháp
- Hiệu lực của một số thuốc tẩy sán dây cho chó - Độ an toàn của thuốc tẩy sán dây cho chó
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. Bố trí thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí điều tra và phương pháp xác định tình hình nhiễm sán dây ở chó
2.3.1.1. Bố trí điều tra tình hình nhiễm sán dây ở chó
Bố trí thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Mổ khám 646 chó ở 3 huyện thành của tỉnh Phú Thọ. Đồng thời, thu thập và xét nghiệm 1.932 mẫu phân chó ở các giai đoạn tuổi khác nhau.
Thu thập, xét nghiệm mẫu và mổ khám chó ở 3 huyện thành được bố trí cụ thể như sau: Địa phƣơng Số chó mổ khám (con) Số mẫu phân xét nghiệm (mẫu) H. Lâm Thao 213 613 H. Phù Ninh 210 767 TP. Việt Trì 223 552 Tổng 646 1.932
2.3.1.2. Phương pháp xác định tình hình nhiễm sán dây ở chó * Phương pháp mổ khám, thu thập và định loại sán dây ở chó.
Để tìm sán dây ký sinh ở hệ tiêu hoá , tiến hành mổ khám chó theo
phương pháp mổ khám không toàn diện cơ quan tiêu hoá , thu thập mẫu sán dây ký sinh ở ruột của chó (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2008 [14]).
Cách mổ khám và thu thập sán dây: Dùng kéo nhọn, sắc cắt dọc theo chiều dài của ruột, nạo nhẹ niêm mạc ruột và gạt toàn bộ chất chứa vào cốc thuỷ tinh dung tích 500 ml có chứa nước sạch. Dùng phương pháp lắng cặn (Benedek, 1943) để thu thập sán dây. Đếm số lượng sán dây ở mỗi chó.
Sán dây sau khi thu thập được làm chết tự nhiên trong nước lã, sau khi
làm sạch bằng nước cất bảo quản trong cồn 700. Phân loại sơ bộ các loài sán
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo của sán dây trưởng thành theo khoá định loại của Phan Thế Việt và cs (1977) [36], Nguyễn Thị Kỳ (2003) [12]. Việc xác định chính xác thành phần loài sán dây ở đường tiêu hoá chó được thực hiện ở Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
* Định loài sán dây: Định loài sán dây theo hệ thống phân loại của Schulz và Gvozdev, 1970 trên tiêu bản nhuộm Carmin (Phan Thế Việt và cs, 1977 [36]; Nguyễn Thị Kỳ, 2003 [12]).
- Làm tiêu bản tạm thời (làm tiêu bản trong): Sử dụng hỗn hợp dung dịch
gồm: glyxerin + axit lactic + nước cất theo tỷ lệ 1:1:1. Phương pháp này có thể quan sát cấu tạo sơ bộ của đầu, giúp cho việc định loài sán dây được nhanh chóng.
- Làm tiêu bản cố định: Chuẩn bị vật dụng thí nghiệm: 1 kính lúp 10 lọ đựng hóa chất 10 chén câu (chén nhuộm) 5 cốc thủy tinh 1 ống đong 2 giá đựng tiêu bản 5 bộ đĩa petri nhỏ
Hóa chất gồm: thuốc nhuộm Carmin, cồn (từ 70o
đến 100o), nước cất, xylen, Bomcanada.
Quy trình nhuộm như sau:
+ Tách mẫu: tách những sán mà cơ thể có đầy đủ các bộ phận (đầu, cổ, thân). + Chọn những mẫu đẹp nhất có cấu tạo đầy đủ (đầu, cổ, thân, đốt già) + Rửa mẫu trong nước cất với thời gian 10 – 15 phút.
+ Ép mẫu: đặt mẫu vào giữa hai lam kính để ép cho mẫu thẳng, các mẫu khác làm tương tự, sau đó đặt các mẫu chồng lên nhau, ngâm trong nước với thời gian 15 phút, sau đó mở ra từ từ.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(Trường hợp mẫu tươi: thu mẫu, rửa nhẹ nhàng cho sạch, gắp từng con đặt cẩn thận lên lam kính cho thẳng rồi đặt lam kính khác lên; tiếp tục với những mẫu khác như vậy. Sau đó đặt chồng lên nhau trong một chậu nhựa có nắp đậy, cho cồn 70o
vào ngập mẫu, để trong 10 ngày nhấc ra cho vào chậu nước 5 – 10 phút để sán tự bong ra, gắp cho vào cồn 70o
, sau 1 tuần đem nhuộm). + Mẫu sán lấy ra từ cồn 700
được cho vào thuốc nhuộm Carmin từ 10 –
15 phút, rồi chuyển sang cồn 700
, 800, 960, 1000 với thời gian 15 – 30 phút (tùy kích thước từng mẫu); rồi làm trong bằng xylen.
+ Chuẩn bị lamen và lam kính, nhỏ 1 – 2 giọt Bomcanada lên lam kính, sau đó lấy que gắp gắp sán đặt lên giọt Bomcanada, đậy lamen lên. Sau một ngày đem ra soi kính hiển vi.
+ Sau khi làm xong mẫu, điền đầy đủ thông tin về mẫu lên lam kính.
* Phương pháp thu thập mẫu phân, xét nghiệm và đánh giá tỷ lệ nhiễm sán dây
- Phương pháp thu thập mẫu phân
Việc thu thập mẫu được tiến hành ngẫu nhiên tại các hộ nuôi chó. Số mẫu phân được lấy ở 3 huyện, thành của tỉnh Phú Thọ (huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh, thành phố Việt Trì).
Mẫu phân chó mới thải ra được thu thập ngẫu nhiên vào các buổi sáng, để trong lọ nhựa có nắp hoặc túi nilon buộc kín. Những mẫu xác định được đúng các thông tin sau thì ghi vào nhãn: loại chó, tuổi, tính biệt, trạng thái phân và các biểu hiện lâm sàng của chó, thời gian, địa chỉ. Những mẫu không xác định được đúng các thông tin thì chỉ ghi nhãn: địa điểm, thời gian lấy mẫu.
Các loại mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng học.
- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây:
Xét nghiệm phân chó tìm đốt sán theo phương pháp lắng cặn Benedek (1943): Cho từng mẫu phân vào cốc thuỷ tinh , thêm 5 - 10 lần nước lã sạch , khuấy tan rồi để yên 15 - 20 phút cho lắng xuống, gạn nước trên đi, lại cho nước
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vào, khuấy tan cặn, để lắng lại rồi gạn... Làm đi làm lại nhiều lần cho đến khi nước trong suốt , cho cặn vào đĩa petri , đặt trên tờ giấy màu đen để quan sát bằng mắt thường và kính lúp tìm các đoạn và các đốt sán dây . Nếu có đốt sán thì dùng bút lông khời ra. Những mẫu phân tìm thấy đốt sán dây được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
* Phương pháp xác định cường độ nhiễm sán dây:
Cường độ nhiễm sán dây được xác định bằng số lượng sán dây ký sinh/chó bằng phương pháp mổ khám, thu thập và đếm số lượng sán ký sinh ở mỗi chó.
Cường độ nhiễm sán dây qua xét nghiệm phân được xác định bằng cách đếm số lượng đốt sán dây/lần thải phân (soi kính lúp, đếm tất cả những đốt sán phát hiện trong mẫu).
2.3.2. Phương pháp bố trí theo dõi và xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó
*Phương pháp bố trí theo dõi:
Chúng tôi thu thập 803 mẫu phân của 3 giống chó xác định được tại 3 huyện thành, trong cùng mùa vụ.
Số mẫu xác định tỷ lệ nhiễm theo giống chó được phân bố như sau:
Giống chó Chó nội Chó lai Chó ngoại Không xác định Đƣợc giống
Số lượng mẫu 399 303 101 1.129
Tổng 803 1.129
* Ghi chú: Những mẫu phân không xác định được là của giống chó nào thì
chỉ dùng để xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo xã, phường điều tra, không dùng để tính tỷ lệ nhiễm theo giống chó.
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó:
Thu thập mẫu và xét nghiệm mẫu tìm đốt sán thải ra trong phân của các giống chó khác nhau được tiến hành theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.3. Phương pháp bố trí theo dõi và xác định tỷ lệ nhiễm sán dây ở chó theo tuổi
* Phương pháp bố trí theo dõi:
Nội dung này chỉ thực hiện trên những chó xác định được tuổi. Số mẫu xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo tuổi chó như sau:
Tuổi chó (tháng) < 2 2 - 6 6 - 12 >12 Không xác định đƣợc tuổi
Số lượng mẫu 108 183 162 159 1.320
Tổng 612 1.320
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo tuổi chó
Thu thập mẫu, xét nghiệm mẫu tìm đốt sán thải ra trong phân của chó ở các giai đoạn tuổi khác nhau được tiến hành theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.1.
2.3.4. Mổ khám, kiểm tra nội tạng trâu bò, lợn và thu thập ấu trùng Cysticercus tenuicollis của sán dây Taenia hydatigena
* Mổ khám trâu bò, lợn tìm ấu trùng Cysticercus tenuicollis
Chúng tôi mổ khám trâu, bò, lợn bằng phương pháp mổ khám phi toàn diện, đếm số lượng ấu trùng Cysticercus tenuicollis ký sinh ở bề mặt các khí quan trong xoang bụng của mỗi trâu, bò, lợn. Số lượng trâu, bò, lợn mổ khám ở các huyện thành cụ thể như sau.
Địa phƣơng Số trâu mổ khám (con) Số bò mổ khám (con) Số lợn mổ khám (con) H. Lâm Thao 71 104 196 H. Phù Ninh 107 153 231 TP. Việt Trì 85 112 214
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phương pháp kiểm tra nội tạng trâu bò , lợn và thu thập ấu trùng Cysticercus tenuicollis.
Bộc lộ xoang ngực và xoang bụng trâu , bò, lợn, phát hiện ấu trùng
Cysticercus tenuicollis ký sinh trên bề mặt gan , lách, màng treo ruột , màng mỡ chài… , đếm số lượng ấu trùng/trâu bò, lợn và bảo quản ấu trùng trong cồn 700
. Ấu trùng Cysticercus tenuicollis có dạng bọc to nhỏ không đều, trong bọc có nhiều nước và một đầu sán dây dính ở màng trong của bọc. Có thể phát hiện
Cysticercus tenuicollis dễ dàng khi xem tươi bằng mắt thường.
2.3.5. Phương pháp bố trí và theo dõi triệu chứng lâm sàng của chó bị bệnh sán dây
* Bố trí theo dõi triệu chứng lâm sàng của chó bị bệnh sán dây
Chúng tôi quan sát, theo dõi những chó có đoạn sán dây ở hậu môn và những chó của các hộ xác định chính xác nhiễm sán dây.
* Phương pháp theo dõi các biểu hiện lâm sàng của chó bị bệnh sán dây
Sử dụng phương pháp chẩn đoán cơ bản (Chu Đức Thắng, 2007 [26]). Trực tiếp quan sát trạng thái cơ thể và các biểu hiện của những chó nhiễm sán dây, kết hợp hỏi chủ nuôi chó về một số thông tin cần thiết , từ đó xác định được các triệu chứng của chó bị bệnh sán dây.
2.3.6. Phương pháp bố trí xác định bệnh tích đại thể, vi thể ở cơ quan tiêu hóa do sán dây gây ra
* Bố trí xác định bệnh tích đại thể và vi thể ở cơ quan tiêu hóa do sán dây gây ra
Nội dung này được thực hiện trên những chó mổ khám thấy nhiễm sán dây ở cường độ nặng.
* Phương pháp xác định bệnh tích đại thể.
- Mổ khám những chó bị nhiễm sán dây, quan sát bằng mắt thường và kính lúp để xác định những biến đổi đại thể đường tiêu hóa, chụp ảnh vùng có bệnh tích điển hình.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phương pháp xác định bệnh tích vi thể.
Biến đổi vi thể được xác định bằng phương pháp làm tiêu bản tổ chức học theo quy trình tẩm đúc parafin, nhuộm Hematoxilin – Eosin, đọc kết quả dưới kính hiển vi quang học Labophot - 2 và chụp ảnh bằng máy ảnh gắn trên kính hiển vi
+ Lấy bệnh phẩm: Cắt phần bệnh phẩm có nhiều tổn thương do sán dây gây ra
+ Cố định bệnh phẩm bằng dung dịch formol 10%.
+ Rửa nước 12 – 24 h (rửa dưới dòng nước chảy nhẹ) để trôi hết formol + Khử nước: Dùng cồn tuyệt đối để rút nước từ trong bệnh phẩm ra
+ Làm trong tiêu bản: Ngâm bệnh phẩm qua hệ thống xylen để làm trong bệnh phẩm
+ Tẩm parafin: Ngâm bệnh phẩm đã làm trong vào các cốc đựng parafin nóng chảy, để ở tủ ấm nhiệt độ 500
C.
+ Đổ Block: Rót parafin nóng chảy vào khuôn giấy rồi đặt miếng tổ chức (bệnh phẩm) đã tẩm parafin vào. Khi parafin đông đặc hoàn toàn thì bóc khuôn. Sửa lại Block cho vuông vắn.
+ Cắt và dán mảnh: Cắt bệnh phẩm trên máy cắt Microtom, độ dày mảnh cắt khoảng 3 – 4 µm. Dán mảnh cắt lên phiến kính bằng dung dịch Mayer (lòng trắng trứng 1 phần, glyxerin 1 phần, 1 ml hỗn hợp trên pha trong 19 ml nước cất).
+ Nhuộm tiêu bản bằng phương pháp Hematoxilin - Eosin.
+ Gắn lamen bằng bomcanada, dán nhãn và đọc kết quả dưới kính hiển vi.
2.3.7. Phương pháp bố trí và xét nghiệm máu của chó bị bệnh sán dây và chó khỏe
* Bố trí xét nghiệm máu chó
Chúng tôi tiến hành hai đợt xét nghiệm máu của chó khỏe và chó bị bệnh sán dây.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Lấy mẫu máu của chó khỏe và chó bị bệnh sán dây ở tĩnh mạch khoeo chân sau (1 ml/ con) vào ống nghiệm có tráng chất chống đông máu.
Đợt xét nghiệm Số chó nhiễm sán dây (con) Số chó khoẻ (con) I 10 10 II 10 10
* Phương pháp xét nghiệm máu của chó bị bệnh sán dây và chó khỏe
Các chỉ tiêu số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, hàm lượng huyết sắc tố, tỷ khối hồng cầu, sức đề kháng của hồng cầu và công thức bạch cầu được
xác định bằng máy Osmetech OPTI – CCA/Blood Gas Analfzen tại bệnh
viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ .
2.3.8. Bố trí thí nghiệm và phương pháp đánh giá hiệu lực tẩy sán dây, độ an toàn của thuốc Niclosamid và Praziquentel cho chó ở 3 huyện thành tỉnh Phú Thọ
* Bố trí thí nghiệm
- Thử nghiệm trên diện hẹp.
Thử nghiệm thuốc tẩy sán dây cho chó trên diện hẹp được thực hiện ở 15 chó nhiễm sán dây nặng (qua xét nghiệm phân) theo sơ đồ sau:
Lô thí nghiệm Tên thuốc và liều lƣợng Số chó dùng thuốc (con) Tuổi chó (tháng) Giống chó Thời gian mổ khám (ngày) Lô I Niclosamid (100 mg/kg TT) 5 2- 6 Chó nội Ngày thứ 15 Lô II Praziquantel (10 mg/kg TT) 5 2- 6 Chó nội Ngày thứ 15
Đối chứng Không dùng thuốc 5 2- 6 Chó nội Ngày thứ 15
- Sử dụng thuốc tẩy cho chó trên diện rộng
Khi đã có kết quả thử nghiệm trên diện hẹp, chúng tôi dùng thuốc tẩy sán dây cho 80 chó ở 2 huyện theo sơ đồ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Địa phƣơng (Huyện) Tên thuốc và liều lƣợng Số chó dùng thuốc (con) Thời gian xét nghiệm phân sau tẩy
(ngày) H. Phù Ninh Niclosamid (100 mg/kg TT) 20 15 Praziquantel (10 mg/kg TT) 20 15 TP. Việt Trì Niclosamid (100 mg/kg TT) 20 15 Praziquantel (10 mg/kg TT) 20 15
* Phương pháp đánh giá hiệu lực tẩy sán dây của thuốc Niclosamid và Praziquantel
Trên diện hẹp
Trước khi dùng thuốc, nhốt riêng mỗi chó ở một cũi, theo dõi, xác định cường độ nhiễm bằng cách đếm số lượng đốt sán/lần thải phân. Sau khi dùng thuốc, xét nghiệm phân chó bằng phương pháp gạn rửa sa lắng tìm đốt sán ở các ngày thứ 1 đến 15. Ngày thứ 15, mổ khám tất cả số chó ở lô thí nghiệm và lô đối chứng, đếm số lượng sán dây/chó. Từ đó đánh giá được hiệu lực tẩy của thuốc:
- Nếu thấy số lượng đốt sán dây/lần thải phân không giảm so với trước dùng thuốc, mổ khám thấy số lượng sán dây/chó nhiều thì đánh giá thuốc không có hiệu lực đối với sán dây.
- Nếu vẫn thấy đốt sán dây nhưng số lượng bình quân/lần thải phân giảm, mổ khám thấy số lượng sán/chó còn rất ít thì đánh giá thuốc có hiệu lực nhưng chưa triệt để.
- Nếu không thấy đốt sán dây trong phân, mổ khám không thấy có sán dây ký sinh thì đánh giá là thuốc có hiệu lực triệt để.
- Độ an toàn của thuốc được đánh giá bằng kết quả theo dõi trạng thái cơ thể, sự vận động, ăn uống và một số phản ứng khác của cơ thể chó trước và sau khi dùng thuốc một giờ.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trên diện rộng
Sau khi đánh giá hiệu lực, độ an toàn của thuốc trên diện hẹp, chúng tôi dùng thuốc với số lượng chó lớn hơn tại hai huyện. Trước khi dùng thuốc, xác