2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
1.2.2.Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Faust E. C. và cs (1929) [42] đã lập nên một phân giống là Spirometra trong giống Diphyllobothrium. Muller (1935) [48] đã mô tả loài Diphyllobothrium
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mansonoides trên mẫu vật tìm được từ chó và mèo ở vùng Syracus (New York).
Đến năm 1937 Muller đề xuất giống Spirometra và thống nhất đổi tên loài
Diphyllobothrium mansonoides thành loài Spirometra mansonoides.
Rudolphi (1918) đã phát hiện ấu trùng của sán dây loài Spirometra ericnaice
trên loài nhím ở châu Âu. Faust E. C. và cs (1929) [42] cũng đã phát hiện ấu trùng loài này trên nhím ở Trung Quốc và dạng sán trưởng thành ở chó. Khi nghiên cứu về hệ enzym của loài Spirometra erinacei ở Nhật Bản và ở Australia, Fukumoto S. và cs (1992) [43] nhận xét rằng hai loài sán này là giống nhau.
Kiểm tra ký sinh trùng ở chó tại 32 ngôi làng nhỏ xung quanh thành phố Brno ở phía Nam huyện Moravia – Séc, Borkovcova M. (2003) [39] cho biết: trong tổng số 699 mẫu phân chó (483 mẫu phân chó trưởng thành, 216 mẫu phân chó nhỏ), tỷ lệ nhiễm Dipylidium caninum ở chó trưởng thành là 2,3%, ở chó nhỏ là 1,9%.
Balicka Ramisz A. và cs (2004) [38] đã nghiên cứu về ký sinh trùng đường tiêu hóa chó từ tháng 3 năm 1999 đến tháng 4 năm 2002 ở các vùng thành phố, nông thôn và lân cận của Tây Bắc Ba Lan. Kết quả kiểm tra 216 mẫu phân chó từ
khu vực Gorzow Wielkopolski cho thấy, chó nhiễm sán Dipylidium caninum ở khu
vực thành thị là29,31% , khu vực nông thôn là 32,5%.
Theo kết quả nghiên cứu của Dalimi A. và cs (2006) [40], kiểm tra 83 chó ở các tỉnh phía tây của Iran cho thấy: có 38,55% chó nhiễm Dipylidium caninum;
53,01% chó nhiễm Taenia hydatigena; 7,23% chó nhiễm Taenia ovis; 4,82% chó nhiễm Multiceps multiceps; 13,25% chó nhiễm Echinococcus granulosus.
Một kết quả nghiên cứu khác của Dubna S. và cs (2007) [41] cho thấy, tỷ
lệ nhiễm sán dây Dipylidium caninum dao động từ 0,7% – 1,3%, thấy nhiều ở
vùng nông thôn. Kết quả nghiên cứu trước đó của Oliveira Sequeira T. (2002) [49] cũng tương tự.
Một nghiên cứu dịch tễ học về giun sán đường tiêu hóa của chó tại hai phòng khám thú y ở Ibadan, Nigeria của Sowemimo O.A. và Asaolu S.O.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(2008) [51] từ tháng 1 năm 2001 đến tháng 12 năm 2002 cho thấy: kiểm tra mẫu phân thu thập từ 959 chó có 24,7% chó nhiễm giun sán, trong đó chó nhiễm sán dây thuộc loài Dipylidium caninum là 0,2%.
Theo kết quả nghiên cứu của Yotko K. và cs (2009) [46], tỷ lệ nhiễm loài
Taenia hydatigena của chó ở vùng Tây Bắc Bulgaria là 47,85%.
Một nghiên cứu khác của Xhaxhiu D. và cs (2010) [56] từ năm 2004 – 2009: mổ khám 111 chó từ các vùng ngoại ô Tirana của Albania để kiểm tra giun sán đường tiêu hóa, phát hiện được 3 loài sán dây là Dipylidium caninum (65,8%);
Taenia hydatigena (16,2%); Echinococcus granulosus (2,7%).
Tylkowska A. và cs (2010) [53] đã kiểm tra 763 mẫu phân chó thu thập ở phía tây của Pomerania (648 mẫu được thu từ khu vực thành phố, 115 mẫu được lấy từ các khu vực nông thôn) từ năm 2006 – 2007 cho thấy, 34,84% chó nhiễm các loài ký sinh trùng, trong đó nhiễm sán dây Dipylidium caninum là 4,07%.
Tuzer E. và cs (2010) [52] đã nghiên cứu hiệu quả của thuốc Praziquantel tiêm để điều trị sán dây ở chó. Tác giả đã tiến hành thí nghiệm trên 26 chó nhiễm sán dây, trong đó có 14 chó nhiễm Dipylidium caninum, 8 chó nhiễm
Taenia spp, 2 chó nhiễm Echinococcus granulosus và 2 chó nhiễm cả hai loài
Dipylidium caninum, Taenia spp. với liều 0,1 ml/ kg thể trọng. Thí nghiệm được
theo dõi chặt chẽ, nhốt riêng từng chó để kiểm tra sự thải phân. Kết quả, sau 2 hoặc 3 ngày dùng thuốc không thấy mẫu phân nào dương tính, không có phản ứng phụ nào xảy ra, hiệu quả tẩy trừ là 100%.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, thời gian, địa điểm nghiên cứu
* Đối tượng nghiên cứu:
- Chó nuôi tại một số địa phương của tỉnh Phú Thọ - Bệnh sán dây ở chó
* Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 08 năm 2010 đến tháng 08 năm 2011.
* Địa điểm nghiên cứu:
- Đề tài được thực hiện ở các xã phường của 3 huyện, thành thuộc tỉnh Phú Thọ (huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh, Thành phố Việt Trì).
- Địa điểm xét nghiệm mẫu:
+ Phòng thí nghiệm Hóa sinh, Khoa Nông Lâm Ngư - Trường Đại học Hùng Vương.
+ Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên.
+ Phòng ký sinh trùng - Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
* Vật liệu nghiên cứu:
- Mẫu phân mới thải của chó (xét nghiệm tìm đốt sán dây). - Chó ở các lứa tuổi (mổ khám tìm sán dây)
- Trâu, bò, lợn ở các lứa tuổi (mổ khám tìm ấu trùng Cysticerscus tenuicollis) - Mẫu máu chó mắc bệnh sán dây và chó khỏe.
- Bệnh phẩm gồm các đoạn ruột non của chó bị bệnh sán dây.
- Kính hiển quang học có gắn máy ảnh , lamen, lam kính, máy Osmetech OPTI – CCA/Blood Gas Analfzen, thuốc nhuộm Hematoxylin - Eosin, các hoá chất và dụng cụ thí nghiệm khác.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ bệnh sán dây ở chó tại Phú Thọ
2.2.1.1. Tình hình nhiễm sán dây ở chó tại các huyện của tỉnh Phú Thọ
- Sự phân bố các loài sán dây ký sinh ở đường tiêu hoá chó tại ba huyện , thành của tỉnh Phú Thọ.
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm sán dây ở chó qua mổ khám
- Tỷ lệ nhiễm sán dây chó ở các địa phương (qua xét nghiệm phân) - Tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó (qua xét nghiệm phân)
- Tỷ lệ nhiễm sán dây theo tuổi chó (qua xét nghiệm phân)
2.2.1.2. Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ nhiễm sán dây Taenia hydatigena ở chó với tỷ lệ nhiễm ấu trùng Cysticercus tenuicollis ở trâu , bò, lợn tại ba huyện, thành của tỉnh Phú Thọ
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng Cysticercus tenuicollis ở trâu, bò, lợn tại ba huyện, thành tỉnh Phú Thọ.
- Xác định tương quan giữa tỷ lệ nhiễm sán dây Taenia hydatigena ở
chó với tỷ lệ nhiễm ấu trùng Cysticercus tenuicollis của trâu , bò, lợn ở ba huyện, thành.
2.2.2. Nghiên cứu bệnh lý và lâm sàng bệnh sán dây ở chó
- Tỷ lệ và những biểu hiện lâm sàng của chó bị bệnh sán dây
- Bệnh tích đại thể, vi thể ở cơ quan tiêu hoá của chó bị bệnh sán dây - Sự thay đổi một số chỉ số huyết học của chó bị bệnh sán dây
2.2.3. Thử nghiệm thuốc tẩy sán dây cho chó và đề xuất biện pháp phòng bệnh
- Hiệu lực của một số thuốc tẩy sán dây cho chó - Độ an toàn của thuốc tẩy sán dây cho chó
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3. Bố trí thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Bố trí điều tra và phương pháp xác định tình hình nhiễm sán dây ở chó
2.3.1.1. Bố trí điều tra tình hình nhiễm sán dây ở chó
Bố trí thu thập mẫu theo phương pháp lấy mẫu chùm nhiều bậc. Mổ khám 646 chó ở 3 huyện thành của tỉnh Phú Thọ. Đồng thời, thu thập và xét nghiệm 1.932 mẫu phân chó ở các giai đoạn tuổi khác nhau.
Thu thập, xét nghiệm mẫu và mổ khám chó ở 3 huyện thành được bố trí cụ thể như sau: Địa phƣơng Số chó mổ khám (con) Số mẫu phân xét nghiệm (mẫu) H. Lâm Thao 213 613 H. Phù Ninh 210 767 TP. Việt Trì 223 552 Tổng 646 1.932
2.3.1.2. Phương pháp xác định tình hình nhiễm sán dây ở chó * Phương pháp mổ khám, thu thập và định loại sán dây ở chó.
Để tìm sán dây ký sinh ở hệ tiêu hoá , tiến hành mổ khám chó theo
phương pháp mổ khám không toàn diện cơ quan tiêu hoá , thu thập mẫu sán dây ký sinh ở ruột của chó (Nguyễn Thị Kim Lan và cs, 2008 [14]).
Cách mổ khám và thu thập sán dây: Dùng kéo nhọn, sắc cắt dọc theo chiều dài của ruột, nạo nhẹ niêm mạc ruột và gạt toàn bộ chất chứa vào cốc thuỷ tinh dung tích 500 ml có chứa nước sạch. Dùng phương pháp lắng cặn (Benedek, 1943) để thu thập sán dây. Đếm số lượng sán dây ở mỗi chó.
Sán dây sau khi thu thập được làm chết tự nhiên trong nước lã, sau khi
làm sạch bằng nước cất bảo quản trong cồn 700. Phân loại sơ bộ các loài sán
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo của sán dây trưởng thành theo khoá định loại của Phan Thế Việt và cs (1977) [36], Nguyễn Thị Kỳ (2003) [12]. Việc xác định chính xác thành phần loài sán dây ở đường tiêu hoá chó được thực hiện ở Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.
* Định loài sán dây: Định loài sán dây theo hệ thống phân loại của Schulz và Gvozdev, 1970 trên tiêu bản nhuộm Carmin (Phan Thế Việt và cs, 1977 [36]; Nguyễn Thị Kỳ, 2003 [12]).
- Làm tiêu bản tạm thời (làm tiêu bản trong): Sử dụng hỗn hợp dung dịch
gồm: glyxerin + axit lactic + nước cất theo tỷ lệ 1:1:1. Phương pháp này có thể quan sát cấu tạo sơ bộ của đầu, giúp cho việc định loài sán dây được nhanh chóng.
- Làm tiêu bản cố định: Chuẩn bị vật dụng thí nghiệm: 1 kính lúp 10 lọ đựng hóa chất 10 chén câu (chén nhuộm) 5 cốc thủy tinh 1 ống đong 2 giá đựng tiêu bản 5 bộ đĩa petri nhỏ
Hóa chất gồm: thuốc nhuộm Carmin, cồn (từ 70o
đến 100o), nước cất, xylen, Bomcanada.
Quy trình nhuộm như sau:
+ Tách mẫu: tách những sán mà cơ thể có đầy đủ các bộ phận (đầu, cổ, thân). + Chọn những mẫu đẹp nhất có cấu tạo đầy đủ (đầu, cổ, thân, đốt già) + Rửa mẫu trong nước cất với thời gian 10 – 15 phút.
+ Ép mẫu: đặt mẫu vào giữa hai lam kính để ép cho mẫu thẳng, các mẫu khác làm tương tự, sau đó đặt các mẫu chồng lên nhau, ngâm trong nước với thời gian 15 phút, sau đó mở ra từ từ.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(Trường hợp mẫu tươi: thu mẫu, rửa nhẹ nhàng cho sạch, gắp từng con đặt cẩn thận lên lam kính cho thẳng rồi đặt lam kính khác lên; tiếp tục với những mẫu khác như vậy. Sau đó đặt chồng lên nhau trong một chậu nhựa có nắp đậy, cho cồn 70o
vào ngập mẫu, để trong 10 ngày nhấc ra cho vào chậu nước 5 – 10 phút để sán tự bong ra, gắp cho vào cồn 70o
, sau 1 tuần đem nhuộm). + Mẫu sán lấy ra từ cồn 700
được cho vào thuốc nhuộm Carmin từ 10 –
15 phút, rồi chuyển sang cồn 700
, 800, 960, 1000 với thời gian 15 – 30 phút (tùy kích thước từng mẫu); rồi làm trong bằng xylen.
+ Chuẩn bị lamen và lam kính, nhỏ 1 – 2 giọt Bomcanada lên lam kính, sau đó lấy que gắp gắp sán đặt lên giọt Bomcanada, đậy lamen lên. Sau một ngày đem ra soi kính hiển vi.
+ Sau khi làm xong mẫu, điền đầy đủ thông tin về mẫu lên lam kính.
* Phương pháp thu thập mẫu phân, xét nghiệm và đánh giá tỷ lệ nhiễm sán dây
- Phương pháp thu thập mẫu phân
Việc thu thập mẫu được tiến hành ngẫu nhiên tại các hộ nuôi chó. Số mẫu phân được lấy ở 3 huyện, thành của tỉnh Phú Thọ (huyện Lâm Thao, huyện Phù Ninh, thành phố Việt Trì).
Mẫu phân chó mới thải ra được thu thập ngẫu nhiên vào các buổi sáng, để trong lọ nhựa có nắp hoặc túi nilon buộc kín. Những mẫu xác định được đúng các thông tin sau thì ghi vào nhãn: loại chó, tuổi, tính biệt, trạng thái phân và các biểu hiện lâm sàng của chó, thời gian, địa chỉ. Những mẫu không xác định được đúng các thông tin thì chỉ ghi nhãn: địa điểm, thời gian lấy mẫu.
Các loại mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu ký sinh trùng học.
- Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây:
Xét nghiệm phân chó tìm đốt sán theo phương pháp lắng cặn Benedek (1943): Cho từng mẫu phân vào cốc thuỷ tinh , thêm 5 - 10 lần nước lã sạch , khuấy tan rồi để yên 15 - 20 phút cho lắng xuống, gạn nước trên đi, lại cho nước
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vào, khuấy tan cặn, để lắng lại rồi gạn... Làm đi làm lại nhiều lần cho đến khi nước trong suốt , cho cặn vào đĩa petri , đặt trên tờ giấy màu đen để quan sát bằng mắt thường và kính lúp tìm các đoạn và các đốt sán dây . Nếu có đốt sán thì dùng bút lông khời ra. Những mẫu phân tìm thấy đốt sán dây được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
* Phương pháp xác định cường độ nhiễm sán dây:
Cường độ nhiễm sán dây được xác định bằng số lượng sán dây ký sinh/chó bằng phương pháp mổ khám, thu thập và đếm số lượng sán ký sinh ở mỗi chó.
Cường độ nhiễm sán dây qua xét nghiệm phân được xác định bằng cách đếm số lượng đốt sán dây/lần thải phân (soi kính lúp, đếm tất cả những đốt sán phát hiện trong mẫu).
2.3.2. Phương pháp bố trí theo dõi và xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó
*Phương pháp bố trí theo dõi:
Chúng tôi thu thập 803 mẫu phân của 3 giống chó xác định được tại 3 huyện thành, trong cùng mùa vụ.
Số mẫu xác định tỷ lệ nhiễm theo giống chó được phân bố như sau:
Giống chó Chó nội Chó lai Chó ngoại Không xác định Đƣợc giống
Số lượng mẫu 399 303 101 1.129
Tổng 803 1.129
* Ghi chú: Những mẫu phân không xác định được là của giống chó nào thì
chỉ dùng để xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo xã, phường điều tra, không dùng để tính tỷ lệ nhiễm theo giống chó.
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo giống chó:
Thu thập mẫu và xét nghiệm mẫu tìm đốt sán thải ra trong phân của các giống chó khác nhau được tiến hành theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.3. Phương pháp bố trí theo dõi và xác định tỷ lệ nhiễm sán dây ở chó theo tuổi
* Phương pháp bố trí theo dõi:
Nội dung này chỉ thực hiện trên những chó xác định được tuổi. Số mẫu xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo tuổi chó như sau:
Tuổi chó (tháng) < 2 2 - 6 6 - 12 >12 Không xác định đƣợc tuổi
Số lượng mẫu 108 183 162 159 1.320
Tổng 612 1.320
* Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm sán dây theo tuổi chó
Thu thập mẫu, xét nghiệm mẫu tìm đốt sán thải ra trong phân của chó ở các giai đoạn tuổi khác nhau được tiến hành theo phương pháp như đã trình bày ở mục 2.3.1.
2.3.4. Mổ khám, kiểm tra nội tạng trâu bò, lợn và thu thập ấu trùng Cysticercus tenuicollis của sán dây Taenia hydatigena
* Mổ khám trâu bò, lợn tìm ấu trùng Cysticercus tenuicollis
Chúng tôi mổ khám trâu, bò, lợn bằng phương pháp mổ khám phi toàn diện, đếm số lượng ấu trùng Cysticercus tenuicollis ký sinh ở bề mặt các khí quan trong xoang bụng của mỗi trâu, bò, lợn. Số lượng trâu, bò, lợn mổ khám ở các huyện thành cụ thể như sau.
Địa phƣơng Số trâu mổ khám (con) Số bò mổ khám (con) Số lợn mổ khám (con) H. Lâm Thao 71 104 196 H. Phù Ninh 107 153 231 TP. Việt Trì 85 112 214
Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
* Phương pháp kiểm tra nội tạng trâu bò , lợn và thu thập ấu trùng Cysticercus tenuicollis.
Bộc lộ xoang ngực và xoang bụng trâu , bò, lợn, phát hiện ấu trùng
Cysticercus tenuicollis ký sinh trên bề mặt gan , lách, màng treo ruột , màng mỡ chài… , đếm số lượng ấu trùng/trâu bò, lợn và bảo quản ấu trùng trong cồn 700