Trên cơ sở các mẫu cho kết quả dương tính với virus đậu dê, tiến hành phân loại theo 3 nhóm tuổi ở dê, cừu: sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, từ 3 đến 6 tháng tuổi và > 6 tháng tuổi. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm virus đậu theo nhóm tuổi của dê, cừu
Dê Cừu Nhóm tuổi Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ ( %) Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Sơ sinh đến < 3 tháng 75 16 21,33 29 0 0 Từ 3 đến 6 tháng 114 35 30,70 51 3 5,88 > 6 tháng 129 29 22,48 62 1 1,61
Nhận xét : Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy: ở nhóm tuổi từ 3 đến 6 tháng ở cả
dê và cừu đều có tỷ lệ mẫu dương tính cao nhất, ở dê có với 35 mẫu dương tính trong 114 mẫu kiểm tra, chiếm 30,70%, ở cừu phát hiện 3 mẫu dương tính trong 51 mẫu kiểm tra chiếm 5,88%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra dịch tễ: bệnh chủ yếu tập trung ở nhóm dê từ 3 đến 6 tháng tuổi.
Nhóm tuổi sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, ở cừu không phát hiện mẫu dương tính nào trong các mẫu kiểm tra, ở dê phát hiện 16 mẫu dương tính trong 75 mẫu kiểm tra, chiếm 21,33%, có tỷ lệ mẫu dương tính thấp nhất.
Ở nhóm tuổi > 6 tháng tuổi, trong 129 mẫu kiểm tra ở dê có 29 mẫu dương tính, chiếm 22,48%, và ở cừu phát hiện được 1 mẫu dương tính trong 62 mẫu kiểm tra.
3.2.3. Xác định tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc
Tính toán tỷ lệ dương tính với virus đậu,dê theo đối tượng gia súc được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc
Loại gia súc Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương
tính Tỷ lệ (%)
Dê 318 80 25,16
Cừu 142 4 2,82
Nhận xét: Bảng số liệu cho thấy ở dê có 80 mẫu dương tính trong 318 mẫu
bệnh phẩm kiểm tra chiếm 25,16%. Đối với cừu chỉ phát hiện 4 mẫu dương tính trong 142 mẫu kiểm tra chiếm 2,82%.
Như vậy tỷ lệ nhiễm virus đậu dê ở dê cao gấp khoảng 10 lần so với ở cừu (P < 0,05). Điều này cũng phản ánh thực tế ở các ổ dịch bùng phát trong những năm qua, dê mắc bệnh trầm trọng hơn ở cừu, tỷ lệ chết cũng cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các tác giả Kitching RP, 1986 House JA 1992; và Tulman ER et al, 2002; trong điều kiện tự nhiên, virus đậu dê chỉ gây nhiễm cho dê mà ít gây nhiễm cho cừu. Có thể nói rằng vật chủ ưa thích của các chủng virus đậu dê khác nhau là do khả năng thích nghi của chúng trên dê hoặc cừu trên những vùng địa lý khác nhau là khác nhau. Theo đó chủng virus đậu dê ở khu vực miền Trung chủ yếu gây bệnh cho dê, ít nhiễm chéo qua cừu.
3.4. Xác định gen quyết định kháng nguyên P32 quy định yếu tố độc lực của virus
đậu dê để phục vụ cho việc nghiên cứu gen cấu trúc kháng nguyên và miễn dịch học.
Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập có kết quả PCR dương tính với virus đậu dê, chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 17 mẫu DNA đã được chiết tách theo các vùng địa lý khác nhau đại diện cho các địa phương nghiên cứu và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi P32F và P32R. Sản phẩm PCR sau khi điện di có độ dài là 976 bp thu được đều có ở 17 mẫu DNA tham gia phản ứng. Từ kết quả này chúng tôi tiến hành thu 17 đoạn gen P32 (từ sản phẩm đã điện di) sau đó sử dụng bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Invitrogen để làm tinh sạch đoạn gen P32 và chạy lại điện di sản phẩm đã tinh sạch. Kết quả thể hiện ở hình dưới đây.
Hình 3.3. Sản phẩm chạy PCR của đoạn gen P32
Từ kết quả ở hình ảnh PCR ở trên cho thấy chỉ có các mẫu số 1,2,4,5,13,15 là có band tương ứng với 976 bp, các mẫu còn lại đều cho kết quả âm tính.
Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu chứa đoạn gen P32 trong các mẫu kiểm tra
Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
17 6 35,29
Để lý giải điều này chúng tôi cho rằng các mẫu âm tính có thể do đoạn gen P32 bị đứt gãy do tác động của tia UV hoặc do sai số trong quá trình tinh sạch gen P32.
3.5. Quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu
Từ kết quả ở trên cho phép đề xuất quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu như sau:
Hình 3.4. Quy trình chẩnđoán bệnhđậu dê, cừu
Giải thích quy trình:
- Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê hoặc cừu nghiền bằng cối, chày sứ cùng dung dịch PBS tỷ lệ 1/10 để tách đồng hoá tế bào. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vô trùng (0,45µm).
- Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml. Thêm 200µl vảy mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều. Cho 200µl dung dịch
Mẫu bệnh phẩm dịch
mụn đậu, vảy đậu,
máu, mô phổi
Xử lý mẫu Chiết tách DNA của virus đậu Chạy PCR với cặp mồi P1 và P2 Chạy điện di Đọc kết quả
AL vào tube 1,5ml (nếu để đông thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng). Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
- Loại bỏ Protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào tube, vortex kĩ trong 15 phút, đem ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube. Chuyển phần nước sang cột lọc QIAam có tube bên dưới (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Sau đó đem đi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1 vào cột lọc. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. - Thu DNA: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube chứa nước đã lọc.
- Hoà vào dung dịch TE: cho 200 µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong vòng 1 phút. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAam.
- Bảo quản: đậy tube, ghi số hiệu, bảo quản – 700C .
Sau đó lấy 10µl DNA mẫu đí kiểm tra bằng phương pháp PCR trong máy luân nhiệt với thành phần Master Mix được trình bày ở bảng 2.1 với chu trình nhiệt cụ thể như sau:
Bước đầu làm biến tính DNA ở 940C trong 4 phút. Tiếp theo 35 chu kỳ - 470C trong 1 phút.
- 720C trong 1 phút. - 950C trong 45 giây. Cuối cùng 720C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên bộ điện di nằm ngang (Apelex, Model MiniGel XL). Sau khi lấy ra khỏi buồng điện di, chuyển gel lên bộ đọc điện di (Model Bioprint, Vilber Lourmat, France) có gắn hệ thống chụp ảnh điện di (Model Bioprint 1000/20) nối với máy tính. Đọc kết quả.
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
4.1. Kết luận
Bằng phương pháp điều tra dịch tễ và phân tích DNA, chúng tôi rút ra một số kết luận
1. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu trung bình tại các địa phương nghiên cứu là 7,00%.
2. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu ở mùa mưa là 8,63%, cao hơn mùa khô với 5,81%.
3. Nhóm tuổi có số lượng dê, cừu nghi mắc bệnh đậu cao nhất là từ 3 đến 6 tháng tuổi, tiếp đó là nhóm tuổi từ sơ sinh đến 3 tháng tuổi và thấp nhất là nhóm tuổi > 6 tháng tuổi.
4. Đã sử dụng phương pháp PCR và kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với virus đậu dê ở 2 khu vực chăn nuôi: trang trại và hộ gia đình trung bình là 18,26%,
5. Tỷ lệ nhiễm virus cao nhất thuộc nhóm tuổi từ 3 – 6 tháng với 30,70% ở dê và 5,88 ở cừu.
6. Đã tinh sạch được đoạn gen P32 phục vụ cho nghiên cứu gen cấu trúc kháng nguyên và miễn dịch học.
4.2. Đề xuất ý kiến.
1. Nghiên cứu thêm về đặc tính sinh học và dặc tính di truyền về gen của virus đậu dê ở Việt Nam và so sánh sự sai khác về cấu trúc gen với các chủng virus đậu dê đã công bố trên thế giới.
2. Nghiên cứu chế tạo vaccine phòng bệnh đậu dê phù hợp với tính kháng nguyên của các chủng virus phân lập.
TÀI LIỆU THAM KHẢO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiếng Việt:
1. Đinh Quang Bình, Đinh Quang Sức ( 2000 ), Kỹ thuật chăn nuôi dê, NXB Nông Nghiệp Hà Nội
2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương ( 1997 ), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, Hà Nội. 3. Phạm Thành Long, Phương Song Liên, Nguyễn Văn Cảm, Nguyễn Trọng
Cường, Nguyễn Thu Hà ( 2006 ), Kết quả chẩn đoán bệnh đậu dê từ các ổ
dịch tại Việt Nam, Tạp chí KH Kỹ thuật Thú y - tập XIII số 2 – 2006, trang 63 – 66
4. Phạm Thành Long, Tô Long Thành, Nguyễn Thu Hà, Trung tâm chẩn đoán Thú y trung ương ( 2006 ), Bệnh đậu cừu và đậu dê, Tạp chí KH kỹ thuật Thú y - tập XIII số 5 – 2006, trang 83 – 87
5. Phạm Văn Ty ( 2001 ), Miễn Dịch Học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 6. Quyền Đình Thi ( 2004 ), Công Nghệ Sinh Học, tập 1 : Những kỹ thuât cơ
bản trong phân tích ADN, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
7. Tô Long Thành ( 2005 ), Miễn dịch học thực hành, Các loại đáp ứng miễn
dịch, Tạp chí KH kỹ thuật Thú y - tập XII số 2 – 2006, trang 67 – 81. Tiếng Anh
8. Bakog K, Brag S, 1957. Studies of goat pox in Sweden. Nord. VetMed., 9:431 – 439
9. Carn VM, 1993. Control of Capripoxvirus infection. Vaccine, 11 ( 13 ) : 1275 – 1279; 56 ref
10. Datta S, Soman JP, 1991. Host range and physico-chemical characterization
of ‘ Ranchi ’ strain of goat – pox virus. Indian Journal of Animal Sciences,
61 ( 9 ) : 955 – 957 ; 11 ref
11. Davies FG, 1976. Characteristics of a virus causing a pox disease in sheep
and goats in Kenya, with observations on the epidemilogy and control.
Journal of Hygiene, Cambridge, 76 : 163 – 171.
12. Kittching RP, Taylor WP, 1985. Clinical and antigenic ralationship between
isolates of sheep and goat pox viruses.Tropical Animal Health and
Production, 17 ( 2 ) : 64 – 74; 11 ref.
13. Kitching RP, 1983. Progress towards sheep and goat pox vaccine. Vaccine, 1 : 4 – 9.
14. Kitching RP, 1986. Passive protection of sheep against Capripoxvirus. Research in Veterinary Science, 41 ( 2 ) : 247 – 250 ; 9 ref.
15. Pandey AK, Malik BS, Bansal MP, 1969. Studies on sheeppoxvirus. II.
Immune and antibody response with cell culture adapted virus. The Indian
Veterinary Journal, 46 : 1017 – 1023.
16. Rao TVS, Negi BS, Bansal MP, 1997. Use of purified soluble antigens of
sheep pox virus in serrodianosis. Indian Journal of Animal Sciences, 67 (8) :
642 – 645; 21 ref.
17. Sharma SN, Dhanda MR, 1972. Studies on sheep and goat pox viruses (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Pathogenicity. Indian Journal of Animal Health, 11 : 39 – 46. Tantawi HH,
Awad MM, Shony MO, Alwan AH, Hassan FK, 1980.
18. Singh RP, Tiwari AK, Negi BS, 1998. Evaluation of hyperimmune sera
againts goat pox viral antigens. Tropical Animal Health and Production, 30
(4):229 – 232; 7 ref.
19. Tulman ER, Afonso CL, Lu Z, Zsak L, Sur JH, Sandybaev NT, Kerembekova UZ, Zaisev VL, Kutish GF, and Rock DL. The genome of
Sheeppox and Goatpox Viruses. Journal of Virology, June 2002, p. 6054 –
6061, Vol. 76, No. 12. Trang web:
20. http://www.cucchannuoi.gov.vn. Sản xuất chăn nuôi: chăn nuôi dê, cừu
2001 – 2005 : Định hướng phát triển giai đoạn 2006 – 2015. Cục chăn nuôi.
21. http:// www.ninhthuan.gov.vn/sonnt/vn/index.asp. Phòng bệnh trong chăn
nuôi. Trần Công Quang, chi cục Thú y Ninh Thuận, 2008
22. http:// www.vcn.vnn.vn. Một số bệnh thông thường trên dê. Phan Vũ Hải, 2007.