* Các bệnh phẩm dùng để chẩn đoán
Để chẩn đoán và giám định virus, bệnh phẩm có thể là huyết thanh, máu con vật đang thời kỳ nung bệnh, dịch mụn đậu, vảy mụn đậu. Nên lấy mẫu trong tuần đầu tiên khi triệu chứng lâm sàng xuất hiện và bảo quản bệnh phẩm ở nhiệt độ âm 700. Có thể sử dụng các biện pháp chẩn đoán sau đây:
Phân lập virus
Capripoxvirus nói chung và virus đậu dê nói riêng thích nghi nuôi cấy trên
dòng tế bào thận cừu hoặc tinh hoàn cừu sơ cấp. Một số chủng có thể thích nghi với môi trường tế bào vero (tế bào thận khỉ xanh). Virus đậu dê gây bệnh tích tế bào sớm nhất 4 ngày sau khi gây nhiễm. Do đó cần kiểm tra các môi trường tế bào đã nhiễm bệnh phẩm trong vòng 14 ngày.
Cấy vào phôi thai gà
Tiêm huyễn dịch mụn đậu vào màng nhung niệu của phôi thai gà 11 – 13 ngày, sau 3 – 4 ngày hoặc 6 – 7.
ngày sẽ xuất hiện nốt đậu trên màng nhung niệu và gây bệnh tích màng dày, phù nề giống chất gelatin.
Nuôi trên môi trường tế bào thận cừu non và tinh hoàn cừu sơ cấp
Cấy virus vào môi trường tế bào thận cừu non hoặc tinh hoàn cừu một lớp, sau 72 giờ, tế bào có biểu hiện bị thoái hóa, biến dạng và tan vỡ màng tế bào (Cell Pathology Effect).
Quan sát tiểu thể bao hàm chứa hạt dưới kính hiển vi
Chọn mụn đậu chưa vỡ, rửa 2 – 3 lần bằng nước cất rồi lấy mụn đậu hay mủ trong mụn đậu phết lên kính làm tiêu bản nhuộm Giemsa hay Môrôsôp rồi xem kính,quan sát thấy tiểu thể bao hàm quanh nguyên sinh chất.
Phương pháp kháng thể huỳnh quang trực tiếp
Tiêu bản kiểm tra được chuẩn bị từ nốt đậu trên da, phổi được cắt lạnh trên lam kính lấy từ môi trường nuôi cấy tế bào hoặc bệnh phẩm. Cố định tiêu bản bằng
aceton, sau đó ủ với chất cộng hợp (conjugat chế từ huyết thanh thỏ tối miễn dịch kháng Capripoxvirus đã tinh khiết). Rửa tiêu bản, hong khô rồi kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang và đánh giá kết quả.
Phương pháp AGID
Pha thạch agarose 1% trong dung dịch đệm Borat có pH = 8,6. Hấp vô trùng, đổ thạch ra đĩa phản ứng, đục thành cụm gồm 1 giếng ở giữa và 6 giếng xung quanh, đường kính từng giếng là 5mm, khoảng cách tâm điểm của giếng ở giữa và các giếng xung quanh là 7mm. Nhỏ 18µl huyết thanh đối chứng Capripoxvirus
dương tính vào giếng ở giữa, nhỏ vào các giếng xung quanh các mẫu huyễn dịch bệnh phẩm cần xét nghiệm. Dành 2 giếng cho các mẫu kháng nguyên đối chứng dương và âm với thể tích 18µl/giếng. Ủ trong hộp ẩm ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Kiểm tra vạch kết tủa của giếng giữa và các giếng xung quanh [5].
Kĩ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme – Linked
Immunosorbent Assay – ELISA)
Đây là kĩ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ thấp (khoảng 0.1 ng/ml).
Hai kĩ thuật ELISA được dùng nhiều là kĩ thuật gián tiếp và kĩ thuật trực tiếp (còn gọi là kĩ thuật “sandwich” – bánh kẹp).
Kĩ thuật bánh kẹp bao gồm các bước sau: nhỏ kháng huyết thanh chứa kháng thể vào giếng ở bản nhựa để cho kháng thể bám vào thành giếng. Sau đó nhỏ tiếp dịch kháng nguyên cần xét nghiệm. Nếu là kháng nguyên đặc hiệu với kháng thể thì sẽ gắn với kháng thể. Thêm cộng hợp kháng thể gắn enzyme vào giếng để cho kháng thể cộng hợp gắn với kháng nguyên mà trước đó đã gắn với kháng thể đầu tiên, tạo nên một “bánh kẹp” kháng nguyên-kháng thể-kháng nguyên gắn enzyme, cuối cùng bổ sung cơ chất của enzyme. Enzyme thủy phân cơ chất làm thay đổi màu dung dịch. Tốc độ thủy phân của enzyme tỷ lệ thuận với lượng kháng thể gắn enzyme, cũng có nghĩa là tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên cần xét nghiệm.
Kĩ thuật hấp phụ miễn dịch gián tiếp: nhỏ dịch kháng nguyên cho hấp phụ lên thành giếng, nhỏ tiếp huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ. Nếu trong huyết thanh có chứa kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên thì sẽ gắn với nó. Sau đó thêm cộng hợp kháng – kháng thể đã gắn enzyme, thêm cơ chất của enzyme. Tốc độ
thủy phân cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu dung dịch và tỷ lệ thuận với lượng kháng thể cần xác định trong mẫu [6].
Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR)
Phản ứng PCR là kĩ thuật hóa sinh và sinh học phân tử dùng enzyme DNA polymerase để tạo ra số lượng lớn các bản sao DNA mà không sử dụng sinh vật sống như E. coli hay nấm men. Phản ứng PCR được phát minh năm 1985 bởi Kary Mullis và cộng sự. Và đến năm 1993, Kary Mullis đã được nhận giải Nobel hóa học cho phát minh này. DNA polymerase có trong cơ thể sinh vật sống. Trong tế bào, chức năng của nó là sao chép DNA khi tế bào phân chia trong nguyên phân và giảm phân. Hoạt động của enzyme DNA polymerase là tạo sợi DNA bắt cặp bổ sung với sợi khuôn. Một số loại enzyme DNA polymerase thông thường bị biến tính ở nhiệt độ cao, sau này người ta đã tìm được một loại enzyme DNA polymerase chiết tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus có khả năng chịu nhiệt. Nhược điểm của enzyme được tách từ vi khuẩn này là thỉnh thoảng khi sao chép DNA bị mắc lỗi, gây sai sót trong trình tự DNA thu được. Tuy nhiên sai sót này là có thể chấp nhận được (cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide) [2].
PCR là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen. Khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen là ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ. Trước đây, việc tạo dòng – tạo một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA mong muốn - được thực hiện bằng cách chèn đoạn DNA đó vào một vector rồi sau đó biến nạp vào vật chủ là E.coli hoặc nấm men để nhờ bộ máy di truyền của vật chủ mà nhân lên. Sau đó phải tách DNA mong muốn ra khỏi DNA của vật chủ. Quá trình này không những đòi hỏi rất cao về trang thiết bị, kĩ năng thao tác mà còn mất rất nhiều thời gian để có được số lượng bản sao mong muốn. Kĩ thuật PCR ra đời giúp chúng ta có thể tạo ra một lượng lớn bản sao của đoạn DNA mong muốn trong thời gian ngắn, thực hiện đơn giản, ít tốn kém, và yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao. Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR nhanh chóng được áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và cho kết quả rất chính xác. Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử DNA trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong việc phân loại các loài sinh vật.
Kĩ thuật PCR có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác Capripoxvirus
trong các mẫu sinh thiết da và nuôi cấy tế bào trong khi các phương pháp khác đã đề cập ở trên có thể xảy ra phản ứng chéo với một số virus khác.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU