2.4.1. Phương pháp điều tra dịch tễ
Điều tra dịch tễ học bệnh đậu dê, cừu bằng phương pháp hồi cứu dựa vào phiếu điều tra, kết hợp phỏng vấn thú y cơ sở và người chăn nuôi. Các số liệu thu thập được điền vào các chỉ tiêu điều tra trên phiếu điều tra.
* Điều tra tổng thể:
- Tổng đàn dê, cừu. - Giống.
- Phương thức chăn nuôi. - Nguồn thức ăn.
- Hình thức chăn nuôi : trang trại, hộ gia đình.
* Điều tra chi tiết:
- Số lượng dê, cừu theo tuổi.
- Triệu chứng lâm sàng: phỏng vấn người chăn nuôi về các triệu chứng lâm sàng có xảy ra trước thời điểm điều tra.
- Bệnh tích.
- Thời gian bị bệnh.
- Những biểu hiện triệu chứng bệnh tích khác.
Kết thúc đợt điều tra, các số liệu trong phiếu điều tra được tổng hợp lại và xây dựng bảng biểu để phân tích, đánh giá.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu
Thu thập bệnh phẩm: đối tượng lấy mẫu phải là các con vật đang trong thời kì nung bệnh hoặc đang phát bệnh (có biểu hiện sốt cao 40 – 410C, xuất hiện các nốt đậu ở da, sưng hạch lympho, chảy nước mắt, nước mũi và nước bọt, thở khó, kém ăn).
Bệnh phẩm: virus đậu là virus hướng thượng bì nên bệnh phẩm thường lấy là các vảy mụn đậu ở trên da mỏng (vùng bụng, mặt, …), trên niêm mạc và dịch tiết ra ở các mụn nước chưa vỡ. Lấy 1 – 2 g vảy mụn đậu của con vật bị nghi mắc bệnh đậu dê, cừu càng vô trùng càng tốt và bỏ vào lọ có chứa 5 ml môi trường bảo quản virus (dung dịch PBS – Glycerin 50%, pH = 7,6). Ở trường hợp bệnh cấp tính, sốt không phát hiện thấy các tổn thương lâm sàng, hoặc có thể phát hiện thấy các tổn thương < 4 ngày: lấy 5 ml máu toàn phần của con vật đưa vào ống có chứa chất chống đông chuyên dụng.
Các mẫu bệnh phẩm sau khi lấy từ gia súa nghi mắc bệnh đậu dê, cừu được cho vào dung dịch bảo quản đựng sẵn trong lọ thuỷ tinh dày, có nút vặn. Trên mỗi lọ đựng bệnh phẩm dán nhãn ghi các nội dung:
- Số hiệu gia súc. - Loại bệnh phẩm. - Tuổi, giống, tính biệt. - Ngày lấy bệnh phẩm. - Địa chỉ lấy.
- Tên người lấy.
Cho lọ đựng mẫu bệnh phẩm vào hộp thiếc. Sau khi được vận chuyển về đến phòng thí nghiệm, bệnh phẩm cần được bảo quản ở - 800C cho đến khi thí nghiệm.
2.4.3. Phương pháp xử lý mẫu
* Chuẩn bị mẫu:
Bệnh phẩm là mẫu máu, vảy mụn đậu của dê, cừu ốm chết nghi mắc bệnh đậu dê cừu đã thu thập.
* Tách DNA:
Chiết tách DNA bằng kit QIAamp ADN MiniKIT (hãng sản xuất Qiagen – Cat No : 51106). Dụng cụ: Micropipet các loại 100, 200, 1000 (µl), đầu tube các loại tương ứng, tube 1,5 ml (không có DNAase, RNAase).
Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA từ vảy mụn đậu.
Tiến hành:
- Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê hoặc cừu nghiền bằng cối, chày sứ cùng dung dịch PBS tỷ lệ 1/10 để tách đồng hoá tế bào.
- Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vô trùng (0,45µm).
- Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml. Thêm 200µl vảy mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều. Cho 200µl dung dịch AL vào tube 1,5ml (nếu để đông thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng). Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Loại bỏ Protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào tube, vortex kĩ trong 15 phút, đem ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube. Chuyển phần nước sang cột lọc QIAam có tube bên dưới (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Sau đó đem đi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Hoà vào dung dịch TE
Bảo quản – 70 0 C Thu DNA Loại bỏ protein tạp Phá vỡ tế bào Ly tâm tách tế bào Vảy mụn đậu
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1 vào cột lọc. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. - Thu DNA: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube chứa nước đã lọc.
- Hoà vào dung dịch TE: cho 200 µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong vòng 1 phút. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAam.
- Bảo quản: đậy tube, ghi số hiệu, bảo quản – 70 0 C .
2.4.4. Phản ứng PCR
Nguyên tắc của phản ứng:
PCR là phản ứng phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng enzyme DNA – polymerase để nhân nhanh một đoạn DNA mong muốn. Hoạt động của enzyme polymerase là nối sợi đơn DNA và tạo sợi DNA bắt cặp bổ sung với sợi đó. Để làm được điều này cần có cặp mồi gồm một mồi xuôi và một mồi ngược chuyên biệt với đoạn DNA cần nhân lên. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA – polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Cặp mồi này sẽ gắn với đoạn DNA mạch đơn làm khuôn sau khi đã được tháo xoắn tại điểm khởi đầu sao chép. Các đoạn mồi được chọn nằm ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại vị trí bám của mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía các đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm là đoạn DNA có độ dài giới hạn giữa hai đoạn mồi này.
Các yếu tố cơ bản của phản ứng PCR [2]:
- DNA mẫu: phản ứng PCR xảy ra tối ưu trên DNA thật tinh sạch tuy nhiên nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với những đoạn DNA có độ tinh sạch không cao ví dụ như được thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Độ dài của đoạn DNA mẫu dưới 1,5 kb cho kết quả khuếch đại tốt nhất. Với những đoạn DNA có độ dài lớn hơn 3 kb thì phản ứng PCR không hoạt động được.
- Mồi: là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp chuyên biệt với đầu 5’ hay đầu 3’ của đoạn DNA cần khuếch đại. Mồi gồm có mồi xuôi bắt cặp với đầu 5’ và mồi ngược bắt cặp với đầu 3’ của đoạn DNA cần khuếch đại.
- dNTPs (Deoxynucleozide triphosphate): là dung dịch gồm các nucleozide tự do, là nguyên liệu để tổng hợp nên đoạn DNA mong muốn. Nồng độ sử dụng của dung dịch dNTPs tuỳ thuộc vào các điều kiện phản ứng chung.
- DNA polymerase: có vai trò nối sợi đơn DNA và tạo sợi DNA bắt cặp bổ sung với sợi đó. DNA polymerase được sử dụng hiện nay được chiết tách từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus để tránh sự biến tính enzyme polymerase ở nhiệt độ cao.
- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: bao gồm các thành phần sau: Tris HCl, KCl, MgCl2 và gelatine. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tuỳ thuộc vào loại DNA – polymerase sử dụng. Vai trò của dung dịch đệm là tạo sự kết hợp chặt chẽ giữa các dNTP, kích hoạt vị trí hoạt động của DNA – polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR.
Các bước tiến hành phản ứng PCR[11].
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kì và mỗi chu kì gồm có 3 bước: Bước : Biến tính
Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ biến tính của phân tử thường là 90 – 980C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Thời gian lưu tương ứng khoảng 30 giây – 1 phút. Tại nhiệt độ này, các liên kết hidro bị bẻ gãy, phân tử DNA mạch kép bị tách đôi tạo thành các sợi đơn để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Bước 2: Thực hiện phản ứng lai
Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt độ được hạ xuống thấp hơn nhiệt độ biến tính của các mồi, cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 – 700C, tuỳ thuộc nhiệt độ biến tính của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với khuôn. Sau đó bổ sung DNA – polymerase để kéo dài mồi.
Nâng nhiệt phản ứng lên 720C giúp cho DNA – polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt có thể hoạt động tổng hợp tốt nhất. thời gian tuỳ thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Một chu kì gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự lặp lại theo cấp số nhân. Phản ứng xảy ra trong khoảng 25 – 40 chu kì tuỳ thuộc số lượng bản mẫu ban đầu. Sau chu kì cuối, nhiệt độ được duy trì ở 720C trong khoảng 10 phút để tất cả các sợi đơn xoắn lại và tạo nên sản phẩm của phản ứng PCR. Sản phẩm được bảo quản ở 40C.
Hình 2.2. Các bước thực hiện phản ứng PCR
Sau 1 chu kì tạo thành 2 bản
sao củađoạn DNA đích
Biến tính DNA
Bắt cặp giữa mồi và
khuôn
Kéo dài (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau 2 chu kì tạo thành 4 bản
saocủa đoạn DNA đích
Phản ứng PCR
Hỗn hợp phản ứng bao gồm: đoạn
DNA cần khuếch đại, 2 đoạn
mồi(p1, p2), enzyme chịu nhiệt Taq polymerase…
Hỗn hợp phản ứng được
nâng nhiệt lên 950C nhằm
biến tính đoạn DNA đích.
Sau đó hạ nhiệt độ xuống
400C để mồi bắt cặp với
đoạn DNA khuôn.
Nâng nhiệt lên 720 C để enzyme polymerase
* Đọc kết quả của phản ứng PCR
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose để phát hiện đa hình các đợn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp…). Nồng độ phần trăm agarose trong gel phụ thuộc kích thước phân đoạn DNA, thông thường người ta sử dụng gel agarose 0,7%. Trong trường hợp kích thước phân đoạn DNA nhỏ hơn 1kb người ta hay đổ gel 1; 1,5 hoặc 2 % tuỳ thuộc kích thước của nó nhỏ mức nào.
* Nguyên tắc của kỹ thuật điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong phòng thí nghiệm để phân tích các đại phân tử tích điện. trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương pháp điện di để tách, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt bằng enzyme giới hạn và DNA của sản phẩm PCR.
Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về các cực, phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm. Vận tốc di chuyển tuỳ thuộc vào điện tích, khối lượng của chính các phân tử này. Trên cùng một bản gel có cùng một dòng điện chạy qua, những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích sẽ chay được những quãng đường khác nhau sau khoảng thời gian như nhau..
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử phụ thuộc vào khối lượng phân tử tức là số lượng cặp nucleotide và nồng độ chất cấu thành gel. Việc chọn gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách.
Có hai loại gel thường dùng trong điện di:
- Gel agarose: đây là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn DNA có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Ở nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
- Gel polyacrylamide: được dùng để tách các đoạn DNA có kích thước nhỏ, khoảng dưới 500 bệnh phẩm. Với gel polyacrylamide người ta có thể phân tách hai
phân tử DNA chỉ sai khác nhau 1 nucleotide. Thao tác với gel này phức tạp hơn so với gel agarose nên chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu như xác định trình tự DNA, tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp. Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và điện di theo phương thẳng đứng.
Sau khi phân tích bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp hiện hình. Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidiumbromide (C21H20BrN3). Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của phân tử DNA và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Khi đó DNA sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam. Do đó người ta sẽ phát hiện được vị trí của các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kĩ thuật phóng xạ tự ghi hay bằng các đầu đọc tử ngoại chuyên biệt.
Để so sánh và ước lượng kích thước của các phân tử điện di người ta sử dụng “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” ( molecular weight marker – MWM). Đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết. Dựa vào kích thước đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thước các phân tử mục tiêu [2], [7].
2.4.4.1. Chuẩn bị phản ứng
Master mix: 15 µl, thành phần Master Mix cho một phản ứng PCR được trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Thành phần Master Mix cho một mẫu phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích
1 dNTPs 1 µl (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2 Buffer 2,5 µl
3 DNase free Water 7,8 µl
4 MgCl2 1,5 µl
5 Primer sets 2 µl
Sau đó thêm 10 µl mẫu DNA, trộn đều.
2.4.4.2. Thực hiện phản ứng
Thực hiện phản ứng trong máy luân nhiệt theo chương trình sau: Bước đầu làm biến tính DNA ở 940C trong 4 phút.
Tiếp theo 35 chu kỳ - 470C trong 1 phút. - 720C trong 1 phút. - 950C trong 45 giây. Cuối cùng 720C trong 10 phút.
2.4.4.3. Chạy điện di
Chạy điện di sản phẩm PCR trên bộ điện di nằm ngang (Apelex, Model MiniGel XL).
Chuẩn bị gel điện di agarose (1,5%): cân 1,5 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TBE 1X đun trong lò vi sóng để hoà tan agarose, để nguội xuống 50 – 600C cho thêm 6 µl Ethidium bromide lắc đều, đổ ra khuôn đã chuẩn bị sẵn, cắm lược vào. Để agarose đông lại ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Khi gel đã đông cứng, rút lược, cho khuôn vào khay điện di, đổ đệm TBE 1X ngập mặt thạch.
Nạp mẫu DNA: dùng micropipet hút 10 µl sản phẩm PCR vào theo thứ tự giếng. Chạy điện di: sau khi nạp mẫu xong, nối dòng điện dẫn vào buồng điện di với nguồn điện 110 volt, dòng điện 1 chiều, chạy trong 30 phút.
2.4.4.4. Đọc kết quả
Sau khi lấy ra khỏi buồng điện di, chuyển gel lên bộ đọc điện di (Model Bioprint, Vilber Lourmat, France) có gắn hệ thống chụp ảnh điện di (Model Bioprint 1000/20) nối với máy tính. Sản phẩm PCR có độ dài 192 bp là các mẫu dương tính. Từ các mẫu bệnh phẩm có kết quả dương tính với virus đậu dê, tiến hành chọn 17 mẫu DNA đại diện cho các vùng địa lý khác nhau tại 3 địa phương Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắc Lắc và chạy PCR với cặp mồi ERP32 và EFP32 theo thiết kế của Lê Thanh Hòa (Viện Công nghê sinh học 2008) để xác định gen cấu