* Chuẩn bị mẫu:
Bệnh phẩm là mẫu máu, vảy mụn đậu của dê, cừu ốm chết nghi mắc bệnh đậu dê cừu đã thu thập.
* Tách DNA:
Chiết tách DNA bằng kit QIAamp ADN MiniKIT (hãng sản xuất Qiagen – Cat No : 51106). Dụng cụ: Micropipet các loại 100, 200, 1000 (µl), đầu tube các loại tương ứng, tube 1,5 ml (không có DNAase, RNAase).
Hình 2.1. Quy trình tách chiết DNA từ vảy mụn đậu.
Tiến hành:
- Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê hoặc cừu nghiền bằng cối, chày sứ cùng dung dịch PBS tỷ lệ 1/10 để tách đồng hoá tế bào.
- Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vô trùng (0,45µm).
- Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml. Thêm 200µl vảy mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều. Cho 200µl dung dịch AL vào tube 1,5ml (nếu để đông thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng). Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
- Loại bỏ Protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào tube, vortex kĩ trong 15 phút, đem ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube. Chuyển phần nước sang cột lọc QIAam có tube bên dưới (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Sau đó đem đi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Hoà vào dung dịch TE
Bảo quản – 70 0 C Thu DNA Loại bỏ protein tạp Phá vỡ tế bào Ly tâm tách tế bào Vảy mụn đậu
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1 vào cột lọc. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. - Thu DNA: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube chứa nước đã lọc.
- Hoà vào dung dịch TE: cho 200 µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong vòng 1 phút. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAam.
- Bảo quản: đậy tube, ghi số hiệu, bảo quản – 70 0 C .