Trên cơ sở số liệu điều tra, tiến hành phân tích tổng hợp số liệu dê, cừu nghi mắc bệnh chia theo 3 nhóm tuổi: sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, từ 3 đến 6 tháng tuổi và > 6 tháng tuổi. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.2.
Bảng 3.2: Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu theo nhóm tuổi
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: Ở lứa tuổi từ sơ sinh đến < 3 tháng,
Ninh Thuận có tỷ lệ dê nghi mắc bệnh cao nhất: 71 con nghi mắc bệnh trong 823 con điều tra chiếm tỷ lệ 8,63%, tiếp đó là Đắc Lắc có 49 con nghi mắc bệnh trong 791 con điều tra chiếm tỷ lệ 6,19% và thấp nhất là ở Khánh Hòa có 23 con nghi mắc bệnh trong 531 con điều tra chiếm 6,17%. Đối với cừu, Khánh Hòa có tỷ lệ cừu nghi mắc bệnh cao nhất: 6 con nghi mắc bệnh trong 103 con điều tra, tiếp đến là Ninh Thuận có 65 con nghi mắc bệnh trong 1.156 con điều tra.
Ở lứa tuổi từ 3 đến 6 tháng tuổi, tỷ lệ dê nghi mắc bệnh đậu cao nhất ở Ninh Thuận 11,17% với 226 con nghi mắc bệnh trong 2.024 con điều tra, tiếp đó là
Đ ộ tuổi mắc bệnh Sơ sinh đến < 3 tháng Từ 3 đến 6 tháng > 6 tháng Địa phương Loại gia súc Số điều tra Số nghi mắc bệnh Tỷ lệ(%) Số điều tra Số nghi mắc bệnh Tỷ lệ(%) Số điều tra Số nghi mắc bệnh Tỷ lệ(%) Dê 531 23 6,17 943 67 7,10 1052 59 5,61 Khánh Hoà Cừu 103 6 5,80 259 17 6,56 326 16 4,91 Dê 823 71 8,63 2024 226 11,17 2624 213 8,12 Ninh Thuận Cừu 1156 65 5,62 2184 141 6,46 2985 161 5,39 Đắc Lắc Dê 791 49 6,19 1170 83 7,09 1490 93 6,24
Khánh Hòa 7,10% có 67 con nghi mắc bệnh trong 943 con điều tra, thấp nhất ở Đắc Lắc 7,09% với 83 con nghi mắc bệnh trong 1.170 con điều tra. Ở đối tượng cừu, Khánh Hòa là địa phương có tỷ lệ cừu nghi mắc bệnh cao nhất với 17 con nghi mắc bệnh trong 259 con điều tra chiếm 6,56%, Ninh Thuận có số cừu nghi mắc bệnh thấp hơn với 141 con mắc bệnh trong 2.184 con điều tra chiếm tỷ lệ 6,46%.
Ở lứa tuổi < 6 tháng tuổi, cũng như trên, Ninh Thuận là tỉnh có tỷ lệ dê nghi mắc bệnh đậu cao nhất, trong 2.624 con dê điều tra có 213 con nghi mắc bệnh chiếm 8,12%, tỉnh Đắc Lắc điều tra 1.490 con dê thì có 93 con nghi mắc bệnh đậu chiếm 6,24% và thấp nhất là Khánh Hòa trong tổng số 1.052 con dê điều tra có 59 con nghi mắc bệnh đậu chiếm 5,61%.
Bảng số liệu cũng cho thấy, ở lứa tuổi từ 3 đến 6 tháng, tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu là cao nhất, tiếp đến là nhóm tuổi sơ sinh đến < 3 tháng tuổi và thấp nhất ở độ tuổi > 6 tháng tuổi. Thực tế cho thấy trong từng giai đoạn phát triển của dê, cừu từ sơ sinh đến trưởng thành liên quan chặt chẽ đến sự hoàn thiện của các cơ quan trong cơ thể, nhất là hệ thống thần kinh, hệ tiêu hoá và đặc biệt là hệ thống đáp ứng miễn dịch của cơ thể từ đó ảnh hưởng tới khả năng mắc bệnh của dê, cừu. Ở lứa tuổi > 6 tháng, một số dê, cừu đã được tiêm phòng vaccine hoặc sống sót sau vụ dịch nên bản thân đã có kháng thể chống lại bệnh, còn sơ sinh đến < 3 tháng tuổi cũng có thể được nhận miễn dịch thụ động từ mẹ truyền sang.
Kết quả điều tra chỉ mang tính chất tương đối, chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng của dê, cừu mắc bệnh kết hợp với phỏng vấn thú y cơ sở và người chăn nuôi. Vì vậy có thể nhầm lẫn với một số bệnh có triệu chứng lâm sàng giống bệnh đậu dê như:
- Bệnh viêm da có mủ truyền nhiễm còn gọi là bệnh lở miệng - Bệnh lưỡi xanh.
- Bệnh viêm da do nấm.
- Bệnh ghẻ và tăng mẫn cảm ánh sáng. - Côn trùng đốt.
- Viêm phổi do kí sinh trùng. - Ecthyma truyền nhiễm. - Bệnh dịch tả tiểu gia súc.
Chính vì vậy để khẳng định chắc chắn dê có nhiễm bệnh hay không cần làm các xet nghiệm sinh học phân tử tiếp theo như PCR...
3.2. Xác định tỷ lệ nhiễm virus đậu dê trong các mẫu bệnh phẩm kiểm tra bằng
phương pháp PCR
Tiến hành kiểm tra tỷ lệ nhiễm virus đậu trong các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ mắc bệnh đậu dê. Kết quả được thể hiện ở hình 3.2.
Hình 3.2: Sản phẩm chạy PCR
Chú thích: pos: chứng dương; ne: chứng âm; M: marker
Nhận xét: từ kết quả ở hình 3.2 ta thấy 24 mẫu bệnh phẩm kiểm tra có kết quả thể hiên ở trên hình 3.2 đều cho kết quả dương tính với virus đậu dê.
3.2.1. Tỷ lệ nhiễm virus đậu dê theo khu vực chăn nuôi
Tiến hành thu thập tổng số 460 mẫu bệnh phẩm là vảy mụn đậu và dịch mụn đậu của dê, cừu nghi mắc bệnh đậu tại 3 địa phương Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đắc Lắc. Tất cả các mẫu bệnh phẩm được tách chiết DNA và chạy PCR với cặp mồi P1 và P2 theo thiết kế của Ireland và Binepal năm 1998. Sản phẩm PCR thu được sau khi chạy điện di có độ dài là 192 bp. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm virus đậu dê theo khu vực chăn nuôi
Địa phương Khu vực Số mẫu
kiểm tra Số mẫu dương Tính Tỷ lệ(%) Trang trại 75 12 16,00 Khánh Hoà Hộ gia đình 44 10 22,73 Trang trại 119 19 15,97 Ninh Thuận Hộ gia đình 105 22 20,95 Trang trại 66 11 16,67 Đắc Lắc Hộ gia đình 51 10 19,61 Cộng 460 84 18,26
Nhận xét: Từ kết quả phân tích cho thấy: trong số 460 mẫu kiểm tra thu thập
ở hai khu vực chăn nuôi bằng phản ứng PCR đã phát hiện được 84 mẫu dương tính với virus đậu dê, chiếm 18,26%.
Ở khu vực chăn nuôi trang trại: Đắc Lắc có tỷ lệ mẫu dương tính cao nhất phát hiện 11 mẫu dương tính trong 66 mẫu kiểm tra chiếm 16,67%, tiếp đó là Khánh Hoà 12 mẫu dương tính trong 75 mẫu kiểm tra chiếm 16,00%, thấp nhất là Ninh Thuận 15,97%.
Ở khu vực chăn nuôi hộ gia đình: tỷ lệ mẫu dương tính cao nhất là ở Khánh Hoà 22,73% với 10 mẫu dương tính trong 44 mẫu kiểm tra, Ninh Thuận 18,95% có 22 mẫu dương tính trong 105 mẫu kiểm tra, Đắc Lắc có tỷ lệ mẫu dương tính thấp nhất, phát hiện 10 mẫu dương tính trong 51 mẫu kiểm tra chiếm 19,61%.
Bảng số liệu trên cũng cho thấy, khu vực chăn nuôi trang trại có số mẫu dương tính với virus đậu dê thấp hơn ở khu vực chăn nuôi hộ gia đình. Kết quả này có thể do chăn nuôi tập trung với số lượng dê lớn ở khu vực trang trại nên người chủ chăn nuôi có ý thức tiêm phòng vaccine và áp dụng các biện pháp vệ sinh thú y phòng bệnh. Ngược lại, đối với chăn nuôi hộ gia đình, do chăn nuôi cá thể nhỏ lẻ từ 20 – 30 con trong một đàn, vì vậy việc áp dụng công tác phòng bệnh, vệ sinh thú y và tiêm phòng vaccine ít được chú trọng.
Nhìn chung tỷ lệ mẫu dương tính với virus không cao, chỉ chiếm 18,26%. Điều này phù hợp với kết quả điều tra ở trên. Trong năm 2008, dịch bệnh tạm thời lắng xuống dê mắc bệnh thường lẻ tẻ chỉ tập trung ở một đàn hoặc một vài cá thể trong đàn. Đối với những con mắc bệnh qua khỏi hoặc đã nhiễm virus mà không mắc bệnh, về mặt lý thuyết, thì hệ thống miễn dịch của các đối tượng này đều có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch đủ bảo hộ trong vòng 1 năm. Còn đối với những con non được sinh ra từ những con mẹ đã được miễn dịch thì cũng được thừa hưởng miễn dịch thụ động chống lại bệnh thông qua việc bú sữa đầu trong thời gian nhất định sau khi được sinh ra. Đây cũng là minh chứng cho việc dịch bệnh sau thời kì bùng phát mạnh là thời kì dịch tạm thời lắng xuống.
3.2.2. Tỷ lệ nhiễm virus đậu theo nhóm tuổi của dê, cừu
Trên cơ sở các mẫu cho kết quả dương tính với virus đậu dê, tiến hành phân loại theo 3 nhóm tuổi ở dê, cừu: sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, từ 3 đến 6 tháng tuổi và > 6 tháng tuổi. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Tỷ lệ nhiễm virus đậu theo nhóm tuổi của dê, cừu
Dê Cừu Nhóm tuổi Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ ( %) Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Sơ sinh đến < 3 tháng 75 16 21,33 29 0 0 Từ 3 đến 6 tháng 114 35 30,70 51 3 5,88 > 6 tháng 129 29 22,48 62 1 1,61
Nhận xét : Từ kết quả bảng 3.4 cho thấy: ở nhóm tuổi từ 3 đến 6 tháng ở cả
dê và cừu đều có tỷ lệ mẫu dương tính cao nhất, ở dê có với 35 mẫu dương tính trong 114 mẫu kiểm tra, chiếm 30,70%, ở cừu phát hiện 3 mẫu dương tính trong 51 mẫu kiểm tra chiếm 5,88%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra dịch tễ: bệnh chủ yếu tập trung ở nhóm dê từ 3 đến 6 tháng tuổi.
Nhóm tuổi sơ sinh đến < 3 tháng tuổi, ở cừu không phát hiện mẫu dương tính nào trong các mẫu kiểm tra, ở dê phát hiện 16 mẫu dương tính trong 75 mẫu kiểm tra, chiếm 21,33%, có tỷ lệ mẫu dương tính thấp nhất.
Ở nhóm tuổi > 6 tháng tuổi, trong 129 mẫu kiểm tra ở dê có 29 mẫu dương tính, chiếm 22,48%, và ở cừu phát hiện được 1 mẫu dương tính trong 62 mẫu kiểm tra.
3.2.3. Xác định tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc
Tính toán tỷ lệ dương tính với virus đậu,dê theo đối tượng gia súc được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Tỷ lệ dương tính với virus đậu dê theo đối tượng gia súc
Loại gia súc Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương
tính Tỷ lệ (%)
Dê 318 80 25,16
Cừu 142 4 2,82
Nhận xét: Bảng số liệu cho thấy ở dê có 80 mẫu dương tính trong 318 mẫu
bệnh phẩm kiểm tra chiếm 25,16%. Đối với cừu chỉ phát hiện 4 mẫu dương tính trong 142 mẫu kiểm tra chiếm 2,82%.
Như vậy tỷ lệ nhiễm virus đậu dê ở dê cao gấp khoảng 10 lần so với ở cừu (P < 0,05). Điều này cũng phản ánh thực tế ở các ổ dịch bùng phát trong những năm qua, dê mắc bệnh trầm trọng hơn ở cừu, tỷ lệ chết cũng cao hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các tác giả Kitching RP, 1986 House JA 1992; và Tulman ER et al, 2002; trong điều kiện tự nhiên, virus đậu dê chỉ gây nhiễm cho dê mà ít gây nhiễm cho cừu. Có thể nói rằng vật chủ ưa thích của các chủng virus đậu dê khác nhau là do khả năng thích nghi của chúng trên dê hoặc cừu trên những vùng địa lý khác nhau là khác nhau. Theo đó chủng virus đậu dê ở khu vực miền Trung chủ yếu gây bệnh cho dê, ít nhiễm chéo qua cừu.
3.4. Xác định gen quyết định kháng nguyên P32 quy định yếu tố độc lực của virus
đậu dê để phục vụ cho việc nghiên cứu gen cấu trúc kháng nguyên và miễn dịch học.
Từ các mẫu bệnh phẩm thu thập có kết quả PCR dương tính với virus đậu dê, chúng tôi tiến hành chọn ngẫu nhiên 17 mẫu DNA đã được chiết tách theo các vùng địa lý khác nhau đại diện cho các địa phương nghiên cứu và thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi P32F và P32R. Sản phẩm PCR sau khi điện di có độ dài là 976 bp thu được đều có ở 17 mẫu DNA tham gia phản ứng. Từ kết quả này chúng tôi tiến hành thu 17 đoạn gen P32 (từ sản phẩm đã điện di) sau đó sử dụng bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của hãng Invitrogen để làm tinh sạch đoạn gen P32 và chạy lại điện di sản phẩm đã tinh sạch. Kết quả thể hiện ở hình dưới đây.
Hình 3.3. Sản phẩm chạy PCR của đoạn gen P32
Từ kết quả ở hình ảnh PCR ở trên cho thấy chỉ có các mẫu số 1,2,4,5,13,15 là có band tương ứng với 976 bp, các mẫu còn lại đều cho kết quả âm tính.
Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu chứa đoạn gen P32 trong các mẫu kiểm tra
Số mẫu kiểm tra Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%)
17 6 35,29
Để lý giải điều này chúng tôi cho rằng các mẫu âm tính có thể do đoạn gen P32 bị đứt gãy do tác động của tia UV hoặc do sai số trong quá trình tinh sạch gen P32.
3.5. Quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu
Từ kết quả ở trên cho phép đề xuất quy trình chẩn đoán bệnh đậu dê, cừu như sau:
Hình 3.4. Quy trình chẩnđoán bệnhđậu dê, cừu
Giải thích quy trình:
- Nguyên liệu: vảy mụn đậu của dê hoặc cừu nghiền bằng cối, chày sứ cùng dung dịch PBS tỷ lệ 1/10 để tách đồng hoá tế bào.
- Ly tâm tách tế bào: ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần nước nổi, bỏ cặn, lọc qua màng lọc vô trùng (0,45µm).
- Phá vỡ tế bào: cho 20µl Qiagen protease vào đáy tube 1,5ml. Thêm 200µl vảy mụn đậu đã chuẩn bị ở trên (hoặc mẫu máu) vào tube, trộn đều. Cho 200µl dung dịch
Mẫu bệnh phẩm dịch
mụn đậu, vảy đậu,
máu, mô phổi
Xử lý mẫu Chiết tách DNA của virus đậu Chạy PCR với cặp mồi P1 và P2 Chạy điện di Đọc kết quả
AL vào tube 1,5ml (nếu để đông thì phải làm cho tan giá hoàn toàn mới dùng). Để ở nhiệt độ 560C trong 10 phút. Ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube.
- Loại bỏ Protein tạp: cho 200µl Ethanol 96% vào tube, vortex kĩ trong 15 phút, đem ly tâm nhanh để tránh giọt nước bám trên nắp tube. Chuyển phần nước sang cột lọc QIAam có tube bên dưới (chú ý: không để chạm, dính đầu pipet vào mép cột lọc).
Sau đó đem đi ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút.
Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW1 vào cột lọc. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. Cho 500µl dung dịch AW2 vào cột lọc. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube đựng có chứa nước đã lọc. - Thu DNA: ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột lọc QIAam sang tube chứa mới, vứt bỏ tube chứa nước đã lọc.
- Hoà vào dung dịch TE: cho 200 µl dung dịch đệm TE vào cột lọc, để ở trong vòng 1 phút. Ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Giữ nguyên toàn bộ, vứt cột lọc QIAam.
- Bảo quản: đậy tube, ghi số hiệu, bảo quản – 700C .
Sau đó lấy 10µl DNA mẫu đí kiểm tra bằng phương pháp PCR trong máy luân nhiệt với thành phần Master Mix được trình bày ở bảng 2.1 với chu trình nhiệt cụ thể như sau:
Bước đầu làm biến tính DNA ở 940C trong 4 phút. Tiếp theo 35 chu kỳ - 470C trong 1 phút.
- 720C trong 1 phút. - 950C trong 45 giây. Cuối cùng 720C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra trên bộ điện di nằm ngang (Apelex, Model MiniGel XL). Sau khi lấy ra khỏi buồng điện di, chuyển gel lên bộ đọc điện di (Model Bioprint, Vilber Lourmat, France) có gắn hệ thống chụp ảnh điện di (Model Bioprint 1000/20) nối với máy tính. Đọc kết quả.
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
4.1. Kết luận
Bằng phương pháp điều tra dịch tễ và phân tích DNA, chúng tôi rút ra một số kết luận
1. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu trung bình tại các địa phương nghiên cứu là 7,00%.
2. Tỷ lệ dê, cừu nghi mắc bệnh đậu ở mùa mưa là 8,63%, cao hơn mùa khô với 5,81%.
3. Nhóm tuổi có số lượng dê, cừu nghi mắc bệnh đậu cao nhất là từ 3 đến 6