Khi quan sát lát cắt ngang của gan dưới kính hiển vi cho thấy:
Gan cá khỏe được cấu tạo bởi những tế bào gan có hình đa giác, phân biệt
nhau rất rõ ràng, bên trong có một nhân hình cầu và các tế bào liên kết với nhau
bằng cơ liên kết. Kích thước nhân giữa các tế bào khác nhau tương đối đồng đều, tế
bào chất có màu nhạt hơn nhân.
Gan cá bệnh có hiện tượng bị hoại tử. Hiện tượng hoại tử là do tế bào bị chết đi và thường bị vỡ sau một thời gian, nhân của tế bào bị hoại tử thường bắt màu
hematoxylin mạnh. Quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy cấu trúc đa giác của tế bào gan không còn nữa, nhân có màu xanh đậm, không thấy cấu trúc chặt chẽ của cơ
liên kết các tế bào, do đó gan thường bị nhão ra khi bệnh nặng. Quan sát nhiều mẫu
gan cá bệnh khác còn thấy sự xuất hiện với số lượng lớn các tế bào máu, biểu hiện
của sự xuất huyết gan.
Quan sát tiêu bản mô học thận cá cho thấy:
Thận cá khỏe với nhiều tế bào có hình đa giác xếp theo chiều các ống thận,
và mô có cấu trúc rất rõ ràng, phần nguyên sinh chất bắt màu hồng (eosin) và nhân bắt màu xanh (haematocylin).
Hình 3.9. Mô học gan cá khỏe (trái) và gan cá bị bệnh lở loét (phải)
Ngược lại, thận cá bệnh có các ống thận bị phá hủy, ống thận và mô bị hoại
tử, không còn hình dạng rõ ràng, mất mô liên kết, thay vào đó là sự xuất hiện của tế
bào máu, thận không còn cấu trúc ban đầu.
Quan sát tiêu bản mô học cơ cá cho thấy:
Cơ cá khỏe liên kết chặt thành từng bó cơ, không có sự hiện diện của tế bào
máu. Trong khi đó, cá bị bệnh cơ bị nhão ra, không còn liên kết chặt chẽ nữa.
3.3.5. Kết quả nghiên cứu cảm nhiễm vi khuẩn
Sau quá trình phân lập định tính và nghiên cứu mô học, đề tài tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn có tần số xuất hiện và cường độ nhiễm cao nhất
nuôi cấy và tiêm cảm nhiễm.
Aeromonas hydrophila: CH83GLL105
Burkholderia cepacia: CH106TLL217 * Kết quả theo dõi thí nghiệm:
Sau 10 ngày theo dõi thí nghiệm, kết quả cảm nhiễm trở lại của các chủng vi
khuẩn như sau:
Lô thí nghiệm tiêm vi khuẩn A.hydrophila,
Sau khi tiêm xong, cá vẫn bơi lội bình thường. Thời gian phát bệnhđầu tiên
ở 3 lô 103, 105 và 107 cfu/ml là 72 giờ, 46 – 48 giờ và 24 – 31 giờ lần lượt tương ứng. Cá có những biểu hiện bất thường, dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn, bỏ ăn, nổi
lờđờ,bơi sát thành bể.Ở vết tiêm có dấu hiệu xuất huyếtdưới da, sau đó loét ăn ra,
ăn sâu vào cơ, loang thành lỗ lớn ở vị trí bất kì trên thân, hậu môn cá bị sưng to, viêm lên, một số cá vây bụngxơ rách, một số khác vây đuôi bị cụt, cá có biểu hiện
yếu đi, sớm phát triển thành vết loét. Những dấu hiệu này tương tự như mô tả của
Bùi Quang Tề về bệnhđốmđỏ do vi khuẩn Aeromonas di động gây ra ở Việt Nam [182]. Kết quả này cũng giống với “chứng thủng da” Gopalakrishnan (1961) mô tả, tương tự như triệu chứng của bệnh loét, nhiễm trùng máu do A.hydrophila mà
Karunasagar đề cập vào năm 1989 [88]. Randy (1991) mô tả bệnh nhiễm trùng xuất
huyết ở cá với phần nội tạng tích tụ chất lỏng, thiếu máu và hoại tử trong các cơ
quan đặc biệt là thận và gan dẫn đến tỷ lệ tử vong cao [114]. Cá hồi trong nghiên cứu này sau khi mắc bệnh cũng có triệu chứng tương tự, nhẹ thì gan xuất huyết,
nặng thì gan mềm nhão ra, thậnđen thẫm, xuất huyết trong.
Hình 3.12. Tỉ lệ tử vong tích lũy trong thí nghiệm tiêmVK A.hydrophila
Theo đồ thị 4 cho thấy, ở nồng độ 103, 105 cfu/ml và 107 cfu/ml, cá bắt đầu
chết trong ngày thứ 3, thứ 5 và thứ 8 lần lượt tương ứng. Với nồng độ 103 cfu/ml, cá
dường như không có biểu hiện gì, ngoại trừ 1 trường hợp có biểu hiện đặc trưng của
bệnh và chết ở ngày thứ 8. Ở nồng độ 105 cfu/ml, cá chết rải rác, cho tới ngày cuối
cùng thí nghiệm tỷ lệ chết tích lũy là 73.3%. Ở nồng độ 107 cfu/ml, cá chết nhanh chóng hơn, nội quan xuất huyết trầm trọng, nhưng bên ngoài chưa có vết loét, tỷ lệ
6.67 73.3 100 0 20 40 60 80 100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 thời gian (ngày)
tỉ l ệ t ử v o n g t íc h l ũ y % ĐC 10٨3 10٨5 10٨7
tử vong tích lũy đạt tới 100%, chỉ trong vòng 6 ngày. Tỷ lệ tử vong tích lũy giữa
các nghiệm thức khác biệt nhau là có ý nghĩa.
Về mật độ vi khuẩn phân lập lại từ các mẫu bệnh phẩm cho thấy, ở mật độ
tiêm khác nhau, mật độ vi khuẩn nhiễm cho cá cũng khác nhau. Ở nồng độ
103cfu/ml, mật độ vi khuẩn phân lập từ gan là 2.8x103 cfu.ml, ở 105 cfu/ml, phân lập được 7.28 x103cfu/ml, ở 107 cfu/ml, mật độ vi khuẩn phân lập là 1.47x104cfu/ml
Lô thí nghiệm tiêm vi khuẩn Burkholderia cepacia
Sau khi tiêm xong, cá vẫn bơi lội bình thường. Thời gian phát bệnhđầu tiên ở
3 lô 105 và 107 cfu/ml là 48 giờ và 35 giờ lần lượt tương ứng. Cá cũng có những biểu
hiện bất thường như kém ăn, bỏ ăn, nổi lờđờ,bơi sát thành bể. Tuy nhiên, biểu hiện
không giốngnhưở thí nghiệm tiêm Aeromonas hydrophila, cá bị mất màu từng mảng
trên thân, hậu môn sưng to, nhưng không thấy xuất huyết và loét, nội quan có xuất
huyết, gan tím bầm, lá lách thẫmđen,đầu miệng cá có vết trắng bấtthường.
Hình 3.13. Cá sau khi tiêm vi khuẩn A.hydrophila
A. Xuất huyết trên thân B. Loét từ vết tiêm
A B
Ở lô thí nghiệm tiêm mậtđộ 107 cfu/ml, cá chết nhanh chóng sau khi có dấu
hiệu bệnh, trong vòng 4 ngày là chết toàn bộ cá. Trong khi đó, ở lô thí nghiệm 105 cfu/ml, cá chỉ chết rải rác, và đến cuối thí nghiệm, tỉ lệ cá sống sót khá cao 73.33%. Cá ở lô tiêm với mậtđộ 103 cfu/ml vẫn sống bình thường, không có biểu hiện bệnh.
Mậtđộ vi khuẩn phân lậpđượcở lô tiêm 105 cfu/ml là 6.45x103cfu/ml và ở lô tiêm 107 cfu/ml là 1.36x104cfu/ml.
Hình 3.15. Tỉ lệ tử vong tích lũy trong thí nghiệm tiêm VK B.cepacia
Cá ở lô đối chứng vẫn khoẻ mạnh bình thường trong suốt thời gian thí
nghiệm.
Qua kết quả cảm nhiễm vi khuẩn trở lại như trên, có thể khẳng định được vai
trò tác nhân chính của vi khuẩn Aeromonas hydrophila đối với bệnh lở loét trên cá hồi vân.
3.4. Kết quả nghiên cứu nấm:
Phân lập nấm từ mang và vết loét của các mẫu cá bệnh, nuôi cấy trên môi
trường PDA thấy xuất hiện một dạng sợi nấm với đặc điểm như sau:
Sợi nấm màu trắng, chiều dài khoảng 3 – 5mm, bề ngang khoảng 25µm, hình
ống có phân nhánh, nhưng không có vách ngăn, trên đầu sợi nấm mọc lên những túi
bào tử nằm trên 1 cuống dài thẳng đứng, kích thước 35 – 50µm, với các hình thức
sinh sản như sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng túi bào tử kín và sinh sản hữu tính. 0 26.67 100 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 thời gian (ngày) tỉ l ệ tử v o n g t íc h l ũ y % ĐC 10٨3 10٨5 10٨7
Phân loại: Dựa vào tài liệu phân loại của Alexopoulos (1962) [1] xác định đây là dạng nấm bậc thấp Saprolegnia sp. Ngành Heterokontophyta Lớp nấm noãn: Oomycetes Bộ: Saprolegniales Họ: Saprolegniaceae Giống: Saprolegnia Loài: Saprolegnia sp.
Theo kết quả nghiên cứu thì tần số bắt gặp loài nấm này là 11.11%.
Saprolegniađã được phát hiện từ vết lở loét và mang cá.
Theo các báo cáo bệnh học và tài liệu nghiên cứu trên thế giới thì
Saprolegnia là giống nấm bậc thấp, chủ yếu kí sinh trên các đối tượng thủy sản nước ngọt để gây bệnh, phổ biến nhất là bệnh nấm thủy mi. Chúng có thể làm ung trứng cá, làm cá ngứa ngáy, cà vào các vật thể khác làm tróc vẩy trầy da, tạo điều
kiện cho các tác nhân khác xâm nhập, song sự cảm nhiễm nấm sẽ làm gia tăng mức độ trầm trọng của bệnh, tăng tỷ lệ chết. Nấm Saprolegnia spp. mỗi năm làm thiệt
hại tới 50% sản lượng(tươngđương với 40 triệu USD) đối với nghề nuôi cá chình tại Nhật Bản [31].
Ở Việt nam, Bùi Quang Tề cho biết,Saprolegnia sp gây tác hại lớn cho nghề
nuôi trồng thủy sản nước ngọt từ giai đoạn sản xuất giống đến giai đoạn nuôi thịt.
Hình 3.16. Nấm Saprolegnia sp.
D-
100x
Các loài cá nước ngọt, baba, ếch đều nhiễm nấm này. Mùa vụ phát bệnh thường là vào mùa mát mẻ, nhiệtđộ khoảng từ 18 – 250C là nấm phát triển tốt nhất.
Do trong quá trình nghiên cứu, nấm này chỉ được phát hiện với tần số thấp
(2/18 mẫu), cho nên đề tài không thực hiện việc cảm nhiễm nấm trở lại. Một số mẫu
bệnh lở loét nhưng hoàn toàn không có nấm kí sinh nên chưa khẳng định được vai
trò của nấm đối với bệnh này ở cá hồi vân. Chúng có thể là tác nhân cơ hội, trong quá trình cá phát bệnh, sức khỏe yếu, da bị tổn thương nên chúng đã tấn công vào cá.
CHƯƠNG 4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
4.1 Kết luận
1. Các dấu hiệu chính ở cá hồi vân bị bệnh lở loét bao gồm các dấu hiệu sau đây: cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da cá sẫm màu, có vết loét và xuất huyết trên thân, gần
bụng hoặc đường bên, cũng có khi xuất huyết ở phần cơ quanh vết loét, dạ dày
thường trống rỗng, và nội quan bị tổn thương nặng với phần gan bị xuất huyết, cá
nặng gan bị nhão ra và có dịch vàng. Một số cá còn có thể bị mòn cụt vây đuôi.
2. Vi khuẩn phân lập từ mẫu cá hồi vân bị bệnh lở loét gồm có 8 loài vi khuẩn
thuộc 7 giống, 4 họ, 4 bộ, 2 lớp. Bao gồm Aeromonas hydrophila, Burkholderia cepacia, Escherichia hermanii, Escherichia vulneris, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris và Stenotrophomonas maltophilia.
Trong đó, hầu hết các loài vi khuẩn phân lập thuộc họ Enterobacteriacea (5/8 loài) chiếm 62.5%. Tuy nhiên, có hai loài có tần số bắt gặp cao lại không thuộc họ
Enterobacteriacea bao gồm Aeromonas hydrophila (thuộc họ Aeromonadacea) và
Burkholderia cepacia (thuộc họ Burkholderiacea).
Kí sinh trùng bao gồm 3 loài thuộc 2 ngành, 3 lớp, 3 bộ, 3 họ, và 3 giống. Đó
là Trichodina sp, Ichthyophthirius multiliis, và Gyrodactylus sp.
Nấm phân lập từ cá bệnh là Saprolegnia sp thuộc họ Saprolegniaceae với tần
số bắt gặp thấp 11.11%.
3. Qua thí nghiệm cảm nhiễm trong điều kiện in vivo, có thể khẳng định rằng
Aeromonas hydrophila là tác nhân quan trọng trong việc gây bệnh lở loét cho cá hồi
vân.
4. Có 4 loại kháng sinh có khả năng chống lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila
lẫn vi khuẩn Burkholderia cepacia trong phương pháp thử kháng sinh đồ, bao gồm
Erythromycin, Ciprofloxacin, Kanamycin, Streptomycin. Nhưng Erythromycin có
4.2. Đề xuất ý kiến:
1. Quá trình nghiên cứu này chỉ mới áp dụng một số phương pháp truyền
thống để định danh, sự chuẩn xác của phương pháp này chỉ ở mức tương đối. Cần dùng phương pháp gen để định danh lại các loài vi khuẩn phát hiện từ mẫu cá bệnh.
2. Ngoài các chủng vi khuẩn đã cảm nhiễm, các chủng sinh vật còn lại cần được tiếp tục thí nghiệm để xác định khả năng gây bệnh của chúng đối với cá hồi
vân.
3. Mở rộng nghiên cứu chế tạo vaccine phòng một số bệnh thường gặp trong ở cá hồi cũng cần được tính đến trong tương lai gần nhằm thúc đẩy nghề nuôi cá hồi
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Alexopoulos C.J. (1962), Introductory Mycology, second edition, John Wiley & Sons, Inc, New York.
2. Allen, M.B. and E.P. Bergersen, (2002). “Factors influencing the distribution of Myxobolus cerebralis, the causative agent of whirling disease, in the Cache la Poudre River, Colorado”, Diseases of Aquatic Organisms, (49), 51-60.
3. Amend DF (1975), “Detection and transmission of infectious hematopoietic necrosis in rainbow trout”, J Wildlife Dis. (11), 471-478
4. Amend, D. F. , W. T. Yasutake, and R. W. Mead, (1969), “A hematopoiet virus
disease of rainbow trout and sockeye salmon”, Trans. Am. Fish Soc, (98), 796- 804.
5. Amend, D. F. and J.P. Pietsch, (1972), “Virucidal activity of two iodophors to salmoni viruses”, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, (29), 61- 65.
6. Anderson, J.I.W. and D.A. Conroy, (1969), “The pathogenic myxobacteria with special reference to fish diseases”, J. Appl. Bacteriol, (32), 30-39.
7. Anderson, J. and D. Conroy, (1970), “Vibrio disease in Marine fishes”. In: A symposium of fishes and shellfishes, Snieszko, F.F. (Ed.), Special Publication No. 5, American fisheries society, USA.
8. Anon, (2003), “IPN in salmonids”, A report prepared by the Norwegian Seafood Federation (FHL) and VESOO, 115pp.
9. Ateşoğlu, A., (1999), “Gökkuşaği alabaliklarindan Yersinia ruckeri izolasyonu, identifikasyonu ve dokularda indirekt floresan antikor testi ile antijen aranmasõ”, Pendik Vet. Mikrobiyol. Derg., (30): 43-53.
10.Aydin S., Celebi S., Akyurt I., (1997), “Clinical, haematological and pathological investigations of Escheria vulneris in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)”, Fish Pathol, (32), 29–34.
11.Museum of History and Industry (2005), “Bacterial Kidney Disease Bacterial Kidney Disease - Challenges for the 21st Century”, Seattle, WA, USA. 15–17. 12.Ball, H.J., Munro, A.L.S., Ellia, A., Elson, K.G.R., Hodgkiss, W. & McFarlane,
L.S, (1971), “Infectious pancreatic necrosis in rainbow trout in Scotland”,
Nature, (234), 417-418.
13.Balta F., S. Kayis và Altinok I., (2008), “External protozoan parasites in three trout species in the Eastern Black Sea region of the Turkey: intensity, seasonality, and their treatments”, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 28 (4), 157. 14.Banner C.R., Long J.J., Fryer J.L., Rohovec J.S. (1986), “Occurrence of
salmonid fish infected with Renibacterium salmoninarum in the Pacific Ocean”,
Journal of Fish Diseases, (9), 273-275
15.Banner C.R., Rohovec J.S. and Fryer J.L. (1983), “Renibacterium salmoninarum
as a cause of mortality among chinook salmon in salt water”, Journal of the World Mariculture Society, (14), 236-239.
16.Bartholomew, J.L. and P.W. Reno. (2002), “The history and dissemination of whirling disease”, in J.L. Bartholomew and J.C. Wilson, editors, 3-24.
17.Baudin-Laurencin. F., (1987), “IHN in France”, Bull. Eur. Ass.Flsh Pathol, (7), 104.
18.Beakes, G.W., Wood, S.E., and Burr, A.W., (1994), “Features which
characterize Saprolegnia isolates from salmonid fish lesions”, A review. In Salmon Saprolegniasis. Edited by G. J. Mueller. U.S. Department of Energy, Bonneville Power Administration, Portland, Oregon. pp. 33-66
19.Belding, D.L. & Merrill, B. (1935), “A preliminary report upon a hatchery disease of the salmonidae”. Transactions of the American fisheries society, (65), 76 – 84.
20.Bell, G.R., Higgs, D.A. & Traxler, G.S., (1984), “The effects of dietary ascorbate, zinc, and manganese on the development of experimentally induced bacterial kidney disease in sockeye salmon (Oncorhynchus nerka)”. Aquaculture
21.Bernardet, J. F., 1(997), “Immunization with bacterial antigens: Flavobacterium
and Flexibacter infections”, In: Fish Vaccinology. Eds. Gudding, R., A. Lillehaug, P. J. Midtlyng and F. Brown. Dev Biol. Stand. Basel, Karger. (90), 179-188.
22.Bernardet, J. F., F. Baudin-Laurencin, and G. Tixerant, (1988), “First identification of “Cytophaga psychrophila” in France”. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. (8), 104 – 105.
23.Bernardet, J.F. and B. Kerouault, (1989), “Phenoypic and genomic studies of “Cytophaga psychrophila” isolated from diseased rainbout trout in Frane”, Appl. Env. Microbiol., (55), 1796 – 1800.
24.Bernoth, E.M. (1997), “Furunculosis: The history of the disease and of disease research”. In: Furunculosis. Multidisciplinary Fish Disease Research, Bernoth, E.M., Ellis, A.E., Midtlyng, P.J. and Smith, P. (eds). Academic Press, UK. pp. 1- 20.
25.Borg, A.F., (1948), “Studies on myxobacteria associated with diseases in salmonid fishes”, Ph.D. Thesis, University of Washington. Seattle.
26.Borg, A. F., (1960), “Studies on myxobacteria associated with diseases in salmonid fishes”, American Association for the Advancement of Science, Wildlife Disease, Washington, DC. (8), 1–85.
27.Bovo, G., Giogettl, G., Jorgesen, P. E. V., Olesen, N. J., (1987), “Infectious haematopoietic necrosis: first detection in Italy”, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. (7), 124
28.Bragg, R.R., Henton, M.M., (1986), “Isolation of Yersinia ruckeri from rainbow trout in South Africa”, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., (6), 5-6.
29.Brian Austin, D. A. Austin, “Bacterial fish pathogens: disease of farmed and wild fish”, p 11.
30.Brock, D. T. and Madigan, T.M. (1991), “Biology of Microorganisms”, Sixth edition, Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey.
31.Bruno, D.W, (1986), “Histopathology of bacterial kidney disease in laboratory