L ỜI CẢM ƠN
1.4. Hệ VSV sử dụng trong lên men giấm
Vi khuẩn acetic là tác nhân chính của quá trình lên men acetic nên còn được gọi chung là vi khuẩn acetic. Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa và trong không khí tạo acid acetic từ rượu etylic. Trong môi trường đầy đủ oxy và chất dinh dưỡng chúng có thể tăng sinh khối rất nhanh. 1.4.1. Đặc điểm hình thái [1]
- Đa số vi khuẩn acetic là vi khuẩn gram âm.
- Về hình dạng tế bào vi khuẩn acetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước tế bào 0.6-0.8 mm/ 1-3 mm. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, 1 số xếp 2 tế bào, 1 số khác xếp thành chuỗi dài (A.aceti). Một số loại đặc biệt có tế bào hình cầu, có loại hình chỉ. Tùy điều kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi 1 số loài có thể có dạng hình bán nguyệt. Nhiều loài vi khuẩn acetic khi phát triển trên môi trường thiếu thức ăn hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già) dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh.
- Một số vi khuẩn acetic không có khả năng tạo bào tử (A.aceti,
A.schiitzenbachii) và đa số có thể tạo màng nhầy, một số có khả năng di động
nhờ tiên mao, 1 số không có khả năng này (Acetobacter schiitzenbachii).
- Trên môi trường đặc chúng phát triển thành những khuẩn lạc tròn, đều đặn, đường kính trung bình 3 nm.
- Trên môi trường lỏng vi khuẩn acetic chỉ phát triển trên môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau. Một số loại tạo thành màng dày như sứa (0.5mm), nhẵn và trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó 1 lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển. Dung dịch dưới màng bao giờ cũng trong suốt. Khi nuôi cấy màng người ta thấy có sợi cellulose giống như ở trong sợi bông. Một số loại có màng mỏng như giấy celophan, 1 số khác trên bề mặt của màng không nhẵn mà nhăn nheo (A.aceti), 1 số nữa tạo màng mỏng dễ vỡ bám trên thành bình và dung dịch nuôi không trong.
1.4.2. Đặc điểm sinh trưởng [1]
Vi khuẩn acetic phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nấm men, glucose, rượu etylic hay manitol.
Phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25-30oC, pH 3 – 4.5.
Ngoài ra còn thực hiện quá trình oxy hóa lactate, chuyển glucose thành gluconate, oxy hóa không hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất ketone, hay các acid hữu cơ tương ứng.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn Cacbon, Nito và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng. Vi khuẩn acetic sử dụng đường, etylic và các acid hữu cơ làm nguồn Cacbon, muối amon làm nguồn Nito. Trong quá trình phát triển vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với 1 số acid amin như valin, alanin, prolin.
Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotine, acid amin, và biotin… có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn acetic.
Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp poly saccaride phân tử lớn như cellulose, tinh bột, dextran… và người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất công nghiệp. Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông A. xylimum, acetigenum, viizingianum
1.4.3. Một số vi khuẩn thường gặp trong lên men giấm [3]
Có rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng lên men để tạo ra acid acetic. Tất cả các vi khuẩn có khả năng lên men tạo acid acetic được gọi chung là vi khuẩn acetic. Các loại VSV acetic không chỉ có khả năng lên men etylic để tạo thành axit acetic mà còn có khả năng chuyển hóa được rượu propionic thành acit propionic và chuyển hóa rượu butylic thành acit butyric.
Trong số 20 loài đã được nghiên cứu kỹ, cho thấy khả năng áp dụng vào thực tế sản xuất, các giống sau đây được xem như có nhiều ưu điểm hơn cả. Người ta thường sử dụng những giống sau:
- Acetobacter aceti
Trực khuẩn ngắn có dạng hình que kích thước 0,4-0,8 và 1-1,2 mm, không di động thường xếp thành chuỗi dài. Gram âm, màu vàng với thuốc nhuộm iod. Chúng tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gellatin với dịch lên men chứa 10% đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn, không được nâng lên theo thành bình, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (11%), có khả năng tích lũy 6% acid acetic. Nhiệt độ thích hợp phát triển 34oC. Nếu nhiệt độ cao quá 43o C sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê.
-Acetobacter xylinum
Trực khuẩn dạng hình que 2 mm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi không di động. Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose, có thể oxy hóa rượu tạo 4.5% acid acetic trong môi trường, ngoài ra chúng còn có khả năng oxy hóa tiếp acid acetic thành CO2 và H2O.
Hình 1.4. Acetobacter pasteurianum
Trực khuẩn ngắn, hình thái gần giống A. aceti, nhưng khi ta nhuộm chúng với iot, tế bào sẽ cho màu xanh.
Khả năng chịu nổng độ cồn của chúng thấp hơn của A. aceti (khoảng 10%). Trong điều kiện môi trường phát triển chúng có khả năng tạo được 5-6% axit axetic. Các nhà nghiên cứu ở Nhật kết luận trong tổng cộng 178 mẫu phân lập chia thành các nhóm A và B trên cơ sở phân tích PCR lặp đi lặp lại và khuếch đại AND đa hình phân tích ngẫu nhiên cho thấy sự tương đồng tới hơn 99% là A.pastuerianum trong tất cả các giai đoạn của quá trình lên men của 2 loại rượu gạo(homesu và kusrosu). Điều này chứng tỏ trong quá trình sản xuất giấm bằng phương pháp lên men truyền thống, các chủng vi khuẩn thích hợp đã được lựa chọn một cách tự nhiên để sử dụng cho quá trình lên men giấm mà không có bất cứ sự can thiệp khử trùng hay chống tạp nhiễm nào trong suốt thời gian dài. Ngay cả khi trong điều kiện pH thấp của quá trình lên men acid acetic, họ đã rất ngạc nhiên khi thấy rằng hàm lượng gần như nguyên chất của vi khuẩn acid acetic đã được lưu giữ trong một thời gian dài. [10]
Mặt khác, giấm gạo (vinegars) từ lâu đã được sử dụng rất nhiều ở Nhật và Trung Quốc do giấm trong suốt, không màu và nó có hương vị rất tự nhiên đặc
trưng, và có chứa nhiều acid amin và các vitamine nên nó được sử dụng như một thứ nước uống bồi bổ sức khỏe rất hiệu quả. [10]
- Acetobacter orleaneuse
Hình thái vi khuẩn này giống hai vi khuẩn trên, nhưng lại có kích thước nhỏ hơn nhiều. Đặc biệt hai đầu của tế bào thường nhỏ lại. Nhiều trường hợp người ta lẫn lộn vi khuẩn này với vi khuẩn kỵ khí Clostridium. Trong dịch nước cấy, chúng thường tạo ra một váng rất mỏng trên bề mặt. Váng vi khuẩn thường rất chắc, khi nhuộm với iot, tế bào sẽ chuyển sang màu vàng.
- Acetobacter schiitzenbachii
Vi khuẩn này thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên. Chúng không tạo bào tử, không có khả năng chuyển động và thuộc vi khuẩn gram (-). Khi phát triển ở môi trường lỏng, chúng tạo ra lớp màng dày nhưng không chắc. Ở các nước trên thế giới, người ta thường sử dụng chúng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm. Trong điều kiện môi trường thuận lợi, chúng có khả năng tạo được 11-12% axit axetic.
- Acetobacter curvum
Về cơ bản vi khuẩn này giống A. schiitzenbachii . Trong môi trường lên men
thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10-11% axit axetic. Vi khuẩn A. curvum tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường. Nhiệt độ lên men tối ưu của vi khuẩn này là 35-37oC
- Acetobacter suboxydans
Vi khuẩn A.suboxydans được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất vitamin C. Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ cồn rất cao. Lượng axit axetic tạo được từ quá trình lên men khá cao. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28-30oC. Trong quá trình lên men cần phải thông khí liên tục vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất nhiều cho quá trình chuyển hóa cồn thành axit axetic và cho quá trình phát triển.
1.5. Một số ứng dụng của acid acetic[3]
Acid acetic là một loạt acit hữu cơ ứng dụng rộng rãi trong đời sống và trong công nghiệp, bao gồm những ứng dụng quan trọng sau:
1.5.1. Ứng dụng trong chế biến mủ cao su
Trong sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông đặc của mủ trước khi đưa đi chế biến. Để tránh hiện tượng đông đặc của mủ cao su người ta cho NH3 3%. Lượng NH3 dùng tùy thuộc vào loại mủ đem đi sơ chế.
Sau khi pha loãng và khuấy trộn mủ với NH3, lúc sơ chế các sản phẩm tiếp theo người ta cho thêm vào dung dịch acid acetic 2,5% với lượng là 3,5- 10kg/tấn dung dịch mủ cao su, khi cho acit vào người ta khuấy liên tục. Acid acetic thúc đẩy quá trình keo tụ, dung dịch mủ cao su tách thành 2 pha và dễ dàng tách ra theo yêu cầu của công nghệ chế biến từng mặt hàng.
Nhu cầu về acid acetic trong chế biến mủ cao su là hết sức lớn. Hiện nay, nước ta vẫn phải nhập acid acetic từ bên ngoài.
1.5.2. Ứng dụng acid acetic trong ẩm thực và đời sống
Việc tổng hợp các acid hữu cơ trong quá trình lên men làm giấm càng có vị tươi và ngon. Hơn nữa giấm mà có nhiều acid hữu cơ có thể tăng sự ngon miệng, giúp tiêu hóa. Trong nấu nướng thêm 1 chút giấm, trong giấm có acid hữu cơ có thể làm thành phần dinh dưỡng trong thức ăn được chế biến làm cơ thể càng dễ hấp thụ.
Thay cho chanh trong thực đơn các món trộn, salad và còn sử dụng để tẩy rửa một số vết bẩn cứng đầu bám trên đồ dùng gia đình.
Phòng trị cao huyết áp và sơ cứng động mạch [10]: Các nhà nghiên cứu nhật đã nghiên cứu ra trong giấm gạo có chất ngăn một loại hoocmon làm tác nghẽn mạch máu.
Làm đẹp da : Không những ức chế sắc tố da, giảm vết nhăn ở người già mà có thể tăng tuần hoàn máu cho da, thay tế bào già, co rút lỗ chân lông lại, làm cho da vừa mịn vừa láng
1.5.3. Ứng dụng trong công nghiệp khác
Acid acetic còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp chất dẻo tơ sợi. Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng acid acetic nhiều và có chất lượng cao hơn dung dịch acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế biến mủ cao su.
Và acid acetic còn được ứng dụng như chất tẩy rửa, sát trùng diệt khuẩn trong y tế.
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Vi khuẩn acetobacter pasteurianum
Để nghiên cứu quy trình sản xuất giấm đề tài sử dụng giống chủng
Acetobacter pasteurianum. Chủng Acetobacter pasteurianum được mua ở trường
đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh. Chủng được giữ trong môi trường lỏng, tiến hành phân lập rồi cấy vào ống nghiêm thạch nghiêng để giữ giống.
Acetobacter pasteurianum, có hình dạng là trực khuẩn ngắn có dạng hình que, có
màu xanh khi nhuộm chúng với thuốc nhuộm iod, có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ rượu khá cao (khoảng 11%), có khả năng tích lũy 6% acid acetic.
2.1.2. Cơ chất
2.1.2.1. Rượu
Etanol được biết đến như là rượu êtylic hay rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp chất hữu cơ, nằm trong dãy đồng đẳng của rượu metylic, dễ cháy, không màu, là một trong các rượu thông thường có trong thành phần của đồ uống chứa cồn. Trong cách nói dân dã, thông thường nó được nhắc đến một cách đơn giản là rượu. Công thức hóa học của nó là C2H5OH, hay CH3-CH2-OH, viết tóm tắt là C2H6O.
Rượu được dùng như là nguồn nguyên liệu chính cho quá trình lên men giấm. Hệ vi sinh vật axetic thực hiện quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong điều kiện hiếu khí bắt buộc. Khi có mặt rượu trong môi trường, rượu sẽ là cơ chất cho chủng vi khuẩn sử dụng chuyển hóa tạo acid acetic đồng thời cung cấp năng lượng cho chủng vi khuẩn hoạt động. Lúc trong môi trường lên men hết cơ chất (rượu) thì chúng sẽ oxy hóa acid acetic để tạo ra năng lượng cung cấp cho hoạt động của chúng làm giảm hàm lượng acid acetic trong dịch lên men.
Để tiến hành thí nghiệm sử dụng rượu gạo chưng cất, trong suốt được mua ở Ninh Đa – Ninh Hòa. Sau đó tiến hành chưng cất lại và đo độ rượu bằng tỷ trọng kế (xem phụ lục 1).
Tiến hành pha loãng theo công thức C1V1= C2V2 tới 5; 6; 7; 8% tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo.
2.1.2.2. Đường Saccarose C6H12O5
Hình 2.1. Công thức hóa học của đường saccarose
Đường là cơ chất đầu tiên đi vào các chu trình chuyển hóa cung cấp năng lượng cũng như cung cấp nguồn các chất vật liệu cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết tạo nên tế bào. Trong quá trình lên men giấm, đường là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng, năng lượng cho hệ vi khuẩn hoạt động trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Ngoài ra đường còn đóng vai trò tăng vị hài hòa của giấm, làm cho giấm không bị chua gắt như các sản phẩm giấm hóa học.
2.1.2.3. Một số chất khác:
Để quá trình lên men diễn ra nhanh và đạt hiệu quả cao thì ngoài các chất trên còn cần một số muối khoáng và nguồn cung cấp nitơ để duy trì hoạt động sống bình thường của hệ vi khuẩn. Nguồn cung cấp nitơ là các muối amoni, các muối khoáng có trong dịch lên men. Trong môi trường nhân giống còn sử dụng các thành phần sau:
-Diamoni photphat (NH4)2HPO4 nguồn cung cấp nito cho chủng VSV hoạt động -Nước vô trùng -Acid acetic 3% 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nhgiệm Máy đo pH Buret chuẩn đị Nồi hấp thanh trùng Cân địện tử Tỷ trọng kế Bình định mức 250 ml Nồi cách thủy Bình tam giác 100, 250, 1000 ml Cốc đong 100 ml, 250 mL
Thiết bị lên men liên tục Thiết bị chưng cất rượu Pipet 2ml; 10ml
2.1.4. Bao bì thủy tinh
Trong điều kiện thí nghiệm sử dụng loại bao bì thủy tinh miệng hẹp, nắp vừa miệng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nội dung nghiên cứu:
Xác định tỷ lệ một số thành phần của dịch lên men: nồng độ rượu, nồng độ đường, pH.
Xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV (vi khuẩn Acetic pasteurianum) vào dịch
lên men
Xác định thời gian lên men, chế độ thanh trùng sản phẩm
Sơ bộ ứng dụng quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục
Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.2.1. Quy trình dự kiến
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến Rượu gạo,
acid acetic
Đường, (NH4)2HPO4 Nước vô trùng Chuẩn bị dịch lên men Chủng VSV Dịch lên men Lên men Giấm Lọc, lắng Thanh trùng
Bảo ôn, kiểm tra Sản phẩm
Nhân giống Giống thuần chủng
acetobacter pasteurianum
2.2.2.2 Thuyết minh quy trình:
Chuẩn bị dịch lên men:
Nguyên liệu chuẩn bị dịch lên men bao gồm có : đường, rượu, acid acetic và nước vô trùng.
- Rượu để lên men giấm là từ rượu gạo đã chưng cất, đo độ rượu và pha loãng
- Dùng acid acetic với mục đích chống nhiễm tạp và đưa về pH thích hợp cho quá trình lên men
- Nước sử dụng cho quá trình lên men là nước vô trùng tránh các hiện tượng nhiễm tạp trong quá trình lên men.
Bổ sung chủng VSV: Trước khi tiến hành lên men cần nghiên cứu tỷ lệ bổ sung chủng VSV. Số lượng, hoạt lực của chủng VSV trong quá trình lên men có ảnh hưởng quyết định tới thời gian lên men nhanh hay chậm. Vì vậy cần nghiên cứu phương pháp nhân giống và tỷ lệ bổ sung chủng vi khuẩn.