3.4.1. Kết quả thử độ bền với enzyme proteinase K và enzyme trypsin
Tiến hành kiểm tra dịch bacteriocin của chủng CT1.1 và G1 với enzyme proteinase K và trypsin để khẳng định bản chất của chất kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra có phải là bacteriocin hay không. Trong quy trình xử lý, các mẫu đều được chỉnh về pH 7 bằng dung dịch NaOH 2N và HCl 3N và xử lý enzyme catalase để loại trừ ảnh hưởng của acid hữu cơ và H2O2 đến khả năng kháng khuẩn.
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng CT1.1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trƣờng thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Vibrio sp.C1
Kết quả kiểm tra cho thấy, dịch bacteriocin của cả hai chủng CT1.1 và G1 bị mất hoàn toàn khả năng kháng khuẩn khi xử lý với hai loại enzyme proteinase K và trypsin, trong khi đó, mẫu đối chứng là dịch bacteriocin thô vẫn tạo nên vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1 và Vibrio sp. C1 (Hình 3.11 và 3.12). Proteinase K và trypsin là hai enzyme thủy phân protein, dịch thô mất hoạt tính kháng khuẩn chứng tỏ chất kháng khuẩn có chứa thành phần cấu trúc không bền với enzyme thủy phân protein.
Hình 3.12. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng G1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trƣờng thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1
3.4.2. Độ bền nhiệt độ của dịch bacteriocin thô
Sau khi xác định được bản chất của chất kháng khuẩn do các chủng CT1.1 và G1 sinh là là bacteriocin, tiến hành khảo sát một số tính chất của dịch bacteriocin. Dịch bacteriocin của hai chủng CT1.1 và G1 được kiểm tra ở các nhiệt độ khác nhau với mức thời gian khác nhau để xác định khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin thô.
Kết quả thu được cho thấy, hoạt tính bacteriocin của chủng G1 bền hơn so với của chủng CT1.1. Dịch bacteriocin của chủng G1 còn giữ được 46,2% hoạt tính kháng khuẩn sau khi xử lý ở 60oC(45 phút) và 30,8% hoạt tính ở 100oC(30 phút). Với chủng CT1.1 dịch bacteriocin còn giữ được 28,6% hoạt tính kháng khuẩn ở 60oC(45 phút), và 57,1% hoạt tính ở 100oC(15 phút), ở 121oC dịch thô bị mất hoàn toàn hoạt tính.
Bảng 3.6. Đƣờng kính vòng kháng và khả năng kháng Bacillussp. B1.1 còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý nhiệt độ
Chủng vi khuẩn Đối chứng âm Nhiệt độ xử lý 30oC 60oC 30’ 60oC 45’ 100oC 15’ 100oC 30’ 121oC 15’ Đường kính vòng kháng (D-d, mm) CT1.1 0 14 10 4 8 0 0 G1 0 13 11 6 9 4 0 Khả năng kháng (%) CT1.1 100 71,4 28,6 57,1 0 0 G1 100 84,6 46,2 69,2 30,8 0
%: hoạt tính kháng của dịch bacteriocin sinh từ các chủng CT1.1 và G1 khi để ở nhiệt độ phòng (ở 30o
C) được coi là 100%
Hình 3.13. Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau
(M1: đối chứng âm, môi trường TSB; M2: dịch bacteriocin xử lý ở nhiệt độ phòng, M3: dịch bacteriocin xử lý ở 60oC, 30 phút; M4: dịch bacteriocin xử lý 100oC, 30 phút; M5: dịch bacteriocin xử lý ở 121oC trong 15 phút)
Qua đây ta thấy, khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin sinh từ hai chủng CT1.1 và G1 không cao. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ, để định hướng ứng dụng bacteriocin trong sản xuất chế phẩm probiotic cần tối ưu nhiệt độ trong nuôi cấy thu nhận, sản xuất bacteriocin.
3.4.3. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô
pH là yếu tố được biết đến có ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính của các bacteriocin, các bacteriocin khác nhau thì thường có dải pH hoạt động cũng rất đa dạng. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính dịch bacteriocin của hai chủng CT1.1 và G1 được kiểm tra ở các giá trị pH 2, 4, 6, 7, 8 , 10 ,12 sau 20 phút xử lý. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.7, Hình 3.14 và 3.15.
Bảng 3.7. Đƣờng kính vòng kháng Bacillus sp.B1.1 và khả năng kháng còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý pH
Đối chứng Giá trị pH 2 4 6 7 8 10 12 Đường kính vòng kháng (D-d, mm) CT1.1 0 0 4 11 13 12 6 0 G1 0 4 8 13.5 14 13 7,5 0 Khả năng kháng (%) CT1.1 0 30,7 84,6 100 92,3 46,2 0 G1 28,6 57,1 96,4 100 92,9 53,6 0
%: hoạt tính bacteriocin của các chủng CT1.1 và G1 khi ở pH 7 được coi là 100%
Hình 3.14 . Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý ở pH 2÷12
(ở pH = 4 vòng kháng hơi mờ không nhìn thấy rõ trên hình)
Theo kết quả Bảng 3.7 và Hình 3.14 ta thấy dịch bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 bền trong dải pH từ 4÷10, tuy nhiên ở pH 4 và 10 hoạt tính kháng khuẩn đã giảm đáng kể, ở pH 4 dịch bacteriocin giữ được 30,7% hoạt tính và pH 10 còn 46,2% . Ở giá trị pH 2 và 12 dịch bacteriocin không bền và mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn, tại lỗ thạch không xuất hiện vòng kháng khuẩn giống với mẫu đối chứng là môi trường TSB.
Hình 3.15. Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng G1 sau khi xử lý ở pH 2÷12
Đối với dịch bacteriocin sinh từ vi khuẩn G1 dải pH hoạt động rộng hơn so với dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 là pH 2÷10 (Hình 3.15). Dịch bacteriocin của vi khuẩn này vẫn còn hoạt tính trong môi trường acid rất cao pH 2. Ở giá trị pH 12 thì dịch mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn.
Dải pH của các loại bacteriocin sinh từ các chủng CT1.1 và G1 khá rộng so với các bacteriocin được nghiên cứu gần đây, điều này có ý nghĩa thực tiễn lớn bởi phần lớn các bacteriocin đều có khoảng pH hoạt động tương đối hẹp. Với một số nghiên cứu bacteriocin của các chủng thuộc họ lactic như plantaricin thì chỉ hoạt động ổn định tại pH acid và trung tính, tại pH kiềm plataricin bị ức chế và mất hoạt tính nhưng nó sẽ phục hồi lại hoạt động tại pH acid. Với kết quả khảo sát trên, ta có thể thấy đây là hai loại bacteriocin mới có khả năng ứng dụng cao nhờ vào khả năng hoạt động trong dải pH khá rộng này.
3.5. Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin sinh từ vi khuẩn CT1.1 và G1
Khả năng ức chế sinh trưởng của các chủng CT1.1 và G1 đối với các vi khuẩn khác có thể do nhiều nguyên nhân: tiết các acid hữu cơ như lactic acid, acetic acid; sinh ra hydrogen peroxide; hay tiết các chất kháng sinh có bản chất khác nhau bao gồm bacteriocin có bản chất peptide/protein. Ở các khảo sát trên, chúng tôi đã xác định được chất kháng khuẩn do các chủng vi khuẩn sinh ra là bacteriocin.
Để tìm hiểu cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin, chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch bacteriocin thô sinh từ chủng CT1.1 và G1 đến sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus sp. B1.1. Dịch chiết tế bào nuôi 5,5 giờ tuổi của các chủng vi khuẩn với các hoạt độ bacteriocin khác nhau đã được bổ sung vào pha sinh trưởng logarit (sau 2h nuôi cấy) của chủng B1.1.
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 đến sinh trƣởng của
Bacillus sp.B1.1
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của dịch bacteriocin sinh từ chủng G1 đến sinh trƣởng của
Bacillus sp.B1.1
Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch bacteriocin của chủng CT1.1 và G1 đến sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus sp. B1.1, kết quả cho thấy chủng CT1.1 và G1 ức chế sinh trưởng của B1.1 theo cơ chế kháng khuẩn dựa vào khả năng sản sinh bacteriocin. Trong đó, đối với chủng CT1.1, ở hoạt độ bacteriocin là 260, 600
và 910 AU/ml, dịch chiết tế bào sau khi được trung hòa pH của chủng CT1.1 đã ức chế lần lượt là 8%, 21% và 43% khả năng sinh trưởng của B1.1 ở cuối pha log sau 6h nuôi. Đối với chủng G1, ở hoạt độ bacteriocin là 260, 600 và 910 AU/ml ức chế lần lượt là 6%, 18% và 42% khả năng sinh trưởng của B1.1. Kết quả này đã chứng minh cơ chế hoạt động của bacteriocin sinh từ hai chủng CT1.1 và G1 có khả năng kháng khuẩn. Khả năng ức chế sinh trưởng B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 mạnh hơn so với dịch bacteriocin sinh từ chủng G1.
Một nghiên cứu tương tự được Todorov và Dicks (2009) tiến hành đã cho thấy việc bổ sung dịch bacteriocin ST44AM từ vi khuẩn lactic Pediococcus pentosaceus
ST44AM với hoạt độ từ 400-25.600 AU/ml cũng ức chế mạnh theo hiệu ứng nồng độ đối với các chủng vi khuẩn Listeria ivanovii subsp. ivanovii ATCC 19119, L. innocua
2030C và Enterococcus faecium HKLHS khi nuôi trong môi trường MRS.
Qua đó ta thấy, cơ chế kháng khuẩn của hai chủng CT1.1 và G1 là dựa vào khả năng sinh bacteriocin.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1) Các chủng vi khuẩn CT1.1 và G1 có tế bào hình que, thuộc vi khuẩn Gram âm. Chủng CT1.1 có khuẩn lạc màu vàng trong, tâm tròn bóng, màu trắng đục, mọc lan và nhăn, chủng G1 có màu vàng đục, tâm màu trắng, bóng, mọc lan và nhăn. Cả hai chủng là vi khuẩn hiếu khí, sinh hơi và có khả năng lên men một số loại đường (glucose, manitol, lactose).
2) Bằng kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi đã tiến hành định danh và xác đinh được chủng CT1.1 thuộc chi Proteus.
3) Cả hai chủng CT1.1 và G1 đều có khả năng sinh bacteriocin có hoạt tính
đối kháng với cả vi khuẩn Gram âm (Vibrio sp. C1) và Gram dương (Bacillus sp. B1.1). Chúng tôi đã khảo sát được thời điểm sinh bacteriocin có hoạt
tính mạnh nhất của cả hai chủng vi khuẩn là sau 5,5 giờ nuôi cấy vào đầu pha cân bằng.
4) Chủng vi khuẩn CT1.1 được phân lập từ cá giò (Rachycentron canadum) sinh bacteriocin kém bền nhiệt, bị bất hoạt bởi enzyme trypsin và proteinase K nhưng bền ở pH 4÷10. Chủng vi khuẩn G1 được phân lập từ tôm hùm (Panulirus ornatus)sinh bacteriocin bền nhiệt hơn so với chủng CT1.1, bị bất hoạt bởi enzyme proteinase K và trypsin nhưng bền ở pH 2÷10.
5) Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của dịch bacteriocin của chủng CT1.1 và G1 đến sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus sp. B1.1, kết quả cho thấy chủng CT1.1 và G1 ức chế sinh trưởng của B1.1 theo cơ chế kháng khuẩn dựa vào khả năng sản sinh bacteriocin. Trong đó, đối với chủng CT1.1, ở hoạt độ bacteriocin là 260, 600 và 910 AU/ml, đã ức chế lần lượt là 8%, 21% và 43% khả năng sinh trưởng của B1.1 ở cuối pha log sau 6h nuôi. Đối với chủng G1, ở hoạt độ bacteriocin là 260, 600 và 910 AU/ml ức chế lần lượt là 6%, 18% và 42% khả năng sinh trưởng của B1.1.
Kiến nghị
1) Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện lên men đến khả năng sản sinh và thu nhận bacteriocin từ các chủng CT1.1 và G1.
2) Nghiên cứu cấu trúc gen mã hóa bacteriocin của hai chủng này.
3) Tinh chế và xác định các tính chất của bacteriocin tinh khiết từ các chủng này.
4) Nghiên cứu và thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic từ bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 và G1 trong nuôi trồng thủy sản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1) Trần Thị Trưởng An, 2007. Cố định tế bào Lactococcus trên một số chất mang để ứng dụng lên men thu nhận bacteriocin. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Tp. HCM.
2) Nguyễn Văn Duy, 2011. Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn biển sinh bacteriocin dùng làm thuốc đa năng trong nuôi trồng hải sản. Đề cương nghiên cứu cơ bản, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang,
3) Nguyễn Văn Duy, 2011. Phổ ức chế vi sinh vật gây bệnh và gây thối thực phẩm của các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin. Kỷ yếu “Hội nghị Khoa học Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM” lần thứ VIII năm 2011, trang 224-230.
4) Nguyễn Thị Đà, Hoa Thị Minh Tú, Lê Thanh Bình, 2008. Một số tính chất của bacteriocin được tổng hợp bởi vi khuẩn lactic phân lập từ sữa bò tươi.
Tạp chí Khoa học và Công nghệ,tập 46, số 6, trang 33-41.
5) Nguyễn Hữu Đoàn, 2011. Phân lập hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính bacteriocin trong hạt kefir và ứng dụng. Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh.
6) Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty, Nguyễn Thị Kim Quy, 2005. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus plantarum L24.
Tạp chí di truyền học và ứng dụng, số 26/3/2005, trang 34.
7) Nguyễn Thúy Hương, Trần Thị Tưởng An, 2008. Thu nhận Bacteriocin bằng phương pháp lên men bởi tế bào Lactococcus lactic cố định trên chất mang Cellulose vi khuẩn (BC) và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu; Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ, Đại học Quốc gia Tp.HCM, tập 11, số 9, trang 100-109.
8) Nguyễn Thị Thanh Tâm, 2011. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh bacteriocin từ nước dưa lên men truyền thống nhằm bảo quản thực phẩm. Luận văn tốt nghiệp, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang.
9) Nguyễn Đình Trung, 2004. Bài giảng quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản, NXB Nông nghiệp.
10) Phạm Văn Ty, Nguyễn Văn Thành, 2007. Công nghệ sinh học tập 5–Công nghệ vi sinh và môi trường. Nhà xuất bản Giáo Dục.
11) Vũ Ngọc Út, 1999. Ứng dụng chế phẩm sinh học (probiotic) trong nuôi trồng thủy sản. Đại học Cần Thơ.
Tài liệu nƣớc ngoài
12) Blancheton, J.P., Calvas, J., Michel, A.H., Vonau, V., 1987, Intensive shrimp breeding process,US Patent, 119/205.
13) Boyd, C.E., 1996. Effect of Treatment with a Commercial Bacterial Suspension on Water Quality in Catfish Ponds.Dept. of Fisheries and Allied Aquacultures Alabama Agricultural Experiment Station, Auburn University, Alabama.
14) Chen. H, Hoover. G. D, 2003. Bacteriocin and their food applications.
Comprehensive review in food science and food safety.
15) Foster J., 1991, Bacterial culture renovates useless pond, Practical Aquaculture & Lake Management, 12-13.
16) Kamei, Y., Yoshimizu, M., Ezura Y., Kimura, T., 1988. Screening of bacteria with antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries,
Microbiol Immuno l. (32), 67–73.
17) Logan, W.T., Bartlett, S. L., 1998, Water treatment with large numbers of nonpathogenic bacteria to improve yield of aquatic animals, US Patent, 119/230.
18) Nair S., Tsukamoto, K., Shimidu, U., 1985, Distribution of bacteriolytic bacteria in the coastal marine environment of Japan, Bull. Jpn. Soc. Sci. Fish,
51, 1469–1473.
19) Sharma S. S., Chong S., Harcum S. W. 2006, Intein - mediated protein purification of fusion proteins expressed under high - cell density conditions in E. coli, J Biotechnol, 125, 48-56.
20) Todorov S.D., Dicks L.M., 2005. Characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria isolated from spoiled black olives. J Basic Microbiol, 45(4), 312-22.
21) Todorov S.D., Dicks L.M., 2009. Bacteriocin production by Pediococcus pentosaceus isolated from marula (Scerocarya birrea). Int J Food Microbiol,