2.3.6.1. Thử với enzyme proteinase K và trypsin
Mục đích: Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra có
phải là protein hay không.
Nguyên lý: Bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của các enzyme thủy phân proteinase K, enzyme α-chymotrypsin và một số enzyme khác như trypsin sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất tính kháng với các chủng vi khuẩn chỉ thị.
Tiến hành:
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin, thu dịch nuôi cấy ở thời điểm vi khuẩn sinh bacteriocin cực đại (đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất). Ly tâm dịch ở điều kiện 6000 vòng/phút, 30 phút, 5o
C, thu dịch nổi, chuẩn độ pH của dịch về giá trị 7 bằng dung dịch NaOH 2N hoặc bằng HCl 3N. Dịch này được coi là dịch bacteriocin thô.
Trước tiên xử lý dịch thô bằng enzyme catalase sao cho tỉ lệ enzyme/dịch thô đạt nồng độ cuối cùng là 1mg/ml, thời gian xử lý 30 phút, ở nhiệt độ phòng. Bước này có mục đích loại đi ảnh hưởng của H2O2 tới khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin. Dịch thô sau khi được xử lý với enzyme cactalase được chia làm ba mẫu:
Mẫu thứ nhất đem xử lý với enzyme trypsin Mẫu thứ hai đem xử lý với enzyme proteinase K Mẫu còn lại sử dụng làm mẫu đối chứng dương
Với hai loại enzyme proteinase K và trypsin (đã được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml) sẽ được bổ sung vào dịch bacteriocin sao cho tỷ lệ enzyme/dịch bacteriocin thô của vi khuẩn phải đạt nồng độ cuối cùng là 1mg/1ml. Đem ủ trong tủ ấm 37oC, mẫu xử lý proteinase ủ trong 3 giờ và mẫu xử lý trypsin ủ trong 6 giờ, sau đó đem bất hoạt enzyme ở 80o
C trong vòng 15 phút.
Sau khi xử lý enzyme, kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đổ 20 ml môi
trường TSA vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông, trải 100 μl dịch nuôi cấy qua đêm của chủng chỉ thị Bacillus sp. B1.1 hoặc Vibrio sp. C1. Đục lỗ có đường kính 5 mm trên đĩa thạch, nhỏ 70 μl dịch thô ở trên vào lỗ thạch, ủ đĩa ở 37o
C, 12÷16 giờ và kiểm tra sự tạo thành vòng kháng và đo đường kính các vòng kháng khuẩn.
2.3.6.2. Xác định độ bền với nhiệt độ của dịch bacteriocin Mục đích: Mục đích:
Khảo sát khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin thô do vi khuẩn sinh ra ở những thang nhiệt độ khác nhau, từ đó giúp cho việc nuôi cấy, thu dịch bacteriocin hiệu quả hơn, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và bảo quản chế phẩm probiotic sau này.
Nguyên lý:
Bacteriocin có bản chất là protein, khi bị tác động bởi nhiệt độ hoạt tính của dịch có thể bị giảm hoặc mất đi do cấu trúc của protein bị biến đổi. Mức độ ảnh hưởng đến hoạt tính của dịch bacteriocin tùy theo nhiệt độ và thời gian xử lý nhiệt.
Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn và tiến hành thu dịch bacteriocin thô (các thao tác thu hồi dịch đã nêu trước đó), chuẩn độ pH về giá trị 7. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5 ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 60oC, 100oC bằng cách ủ ở bể ổn nhiệt (xử lý ở các mức thời gian 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút) và 121oC ở nồi hấp trong vòng 15 phút.
Mẫu đối chứng dương là dịch bacteriocin thô không xử lý nhiệt, để ở nhiệt độ phòng và mẫu đối chứng âm là môi trường TSB.
Sau khi xử lý nhiệt độ, kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị là Bacillus sp. B1.1 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (đã trình bày rõ ở trên).
2.3.6.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin Mục đích: Mục đích:
Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của dịch bacteriocin, tạo điều kiện cho quá trình nuôi cấy, thu hồi bacteriocin có chất lượng tốt nhất.
Tiến hành:
Các thao tác nuôi cấy và chuẩn bị dịch bacteriocin tương tự như trên, hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng có ghi sẵn các giá trị pH cần chuẩn, mỗi ống 10ml dịch.
Chuẩn độ pH ở các thang 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12 bằng dung dịch NaOH 2N và HCl 3N, đem ủ trong tủ ấm 37oC trong vòng 20 phút. Cuối cùng chuẩn độ pH về giá trị 7.
Song song chuẩn bị mẫu đối chứng, là dịch môi trường TSB, thao tác xử lý tương tự như xử lý dịch bacteriocin ở trên.
Kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị là Bacillus sp. B1.1 hoặc Vibrio sp. C1 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Nhỏ 70 μl dịch bacteriocin đã xử lý nhiệt và mẫu đối chứng vào mỗi giếng, nuôi trong tủ ấm ở 37oC, đọc kết quả sau 12÷16 giờ.
2.3.6.4. Xác định hoạt độ của dịch bacteriocin Nguyên lý: Nguyên lý:
Xác định hoạt tính của bacteriocin (AU/ml) theo phương pháp pha loãng một dải nồng độ gấp hai lần liên tiếp. Xác định độ pha loãng cao nhất cho thấy vòng kháng khuẩn, hoạt tính kháng khuẩn của các độ pha loãng được xác định bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Graciela và cộng sự, 1995).
Hoạt tính bacteriocin (AU/ml) được tính theo công thức sau:
Trong đó:
AU: đơn vị hoạt tính
DFi: độ pha loãng cao nhất có vòng kháng khuẩn
Vbacteriocin: thể tích dịch bacteriocin cho vào lỗ thạch (ml)
Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường TSB
Đo mật độ quang OD600 (nm) ban đầu, đưa về giá trị OD600= 0,06
Ly tâm thu dịch bacteriocin thô tại thời điểm vi khuẩn sinh bacteriocin cực đại, chế độ ly tâm 6000 vòng/phút, thời gian 30 phút ở 5o
C. Điều chỉnh pH của dịch bacteriocin thô về giá trị 7 bằng dung dịch NaOH 2N và HCl 3N.
Đem dịch bacteriocin thô pha loãng hai lần liên tiếp bằng nước cất vô trùng (pH = 7) để kiểm tra hoạt tính ức chế.
Đổ 20 ml môi trường TSA vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông, trải 100 μl dịch nuôi cấy qua đêm của chủng chỉ thị Bacillus sp. B1.1. Đục lỗ có đường kính 5 mm trên đĩa thạch, bơm 70 μl dịch thô ở trên vào lỗ thạch, ủ đĩa ở 37oC trong 12÷16 giờ.
Xác định độ pha loãng cao nhất cho thấy vòng kháng khuẩn.
2.3.7. Thí nghiệm xác định cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin
Nguyên lý: Cơ chế kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô được xác định dựa trên kiểu ảnh hưởng của chúng đến sinh trưởng của chủng vi khuẩn chỉ thị (Bacillus sp. B1.1). Dịch chiết tế bào chứa bacteriocin thô được bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị ở giai đoạn đầu của pha log (≈106
CFU/ml). Sinh trưởng của vi khuẩn chỉ thị được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm (OD600) sau mỗi giờ trong vòng 8 giờ. Môi trường nuôi không bổ sung bacteriocin được sử dụng làm mẫu đối chứng (Todorov và Dicks, 2009).
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy TSB, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Nuôi cấy chủng vi khuẩn đích, tiến hành thu dịch bacteriocin thô (quy trình thu dịch đã nêu trước đó), chuẩn pH dịch thô về giá trị 7.
Nuôi cấy chủng vi khuẩn chỉ thị (Bacillus sp. B1.1) trong môi trường TSB, 37oC, lắc 180 vòng/phút, tiến hành đo OD600 ban đầu và đưa về giá trị OD600 = 0,06. Tiếp tục nuôi cấy, khi giá trị OD600 = 0,4 thì bổ sung dịch bacteriocin ở các nồng độ khác nhau, xác định sinh trưởng của vi khuẩn chỉ thị bằng cách đo giá trị OD600 sau mỗi giờ nuôi cấy trong 8 giờ. Mẫu đối chứng được nuôi ở cùng điều kiện và giá trị OD600 ban đầu như mẫu thử nhưng không bổ sung dịch bacteriocin.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc điểm hình thái và hóa sinh của vi khuẩn CT1.1 và G1 3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc
Chủng CT1.1 được nuôi cấy trong 24 giờ, quan sát thấy có màu vàng trong, tâm màu trắng đục, tròn bóng, khuẩn lạc mọc lan và nhăn đều xung quanh. Thời gian nuôi cấy càng dài, khuẩn lạc mọc lan tạo thành các vòng tròn đồng tâm, phía ngoài đậm trong nhạt dần ở bên (Hình 3.1).
Hình 3.1. Khuẩn lạc chủng CT1.1 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch TSA ở 37oC
(A: khuẩn lạc chủng CT1.1 cấy điểm sau 24 giờ, B: khuẩn lạc cấy trang sau 12 giờ)
Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng G1 nuôi cấy trên môi trƣờng thạch TSA ở 37oC
(A: khuẩn lạc G1 cấy điểm sau 24 giờ nuôi, B: khuẩn lạc cấy ria sau 12 giờ)
A B
Khuẩn lạc vi khuẩn G1 có màu vàng đục, tâm màu trắng, bóng, mọc lan và nhăn, thành nhiều vòng, phía viền ngoài đậm, trong nhạt. Giống với chủng CT1.1, thời gian nuôi cấy càng kéo dài, khuẩn lạc mọc lan càng rộng (Hình 3.2).
3.1.2. Nhuộm Gram
Sau khi tiến hành nhuộm Gram rồi quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại X - 100, ta thấy tế bào của cả hai chủng CT1.1 và G1 đều hình que, đơn và bắt màu đỏ hồng của Fuchsin (Hình 3.3 và 3.4), chứng tỏ hai chủng này là vi khuẩn Gram âm.
Điều này được giải thích do thành tế bào vi khuẩn Gram âm ngoài lớp peptidoglycan mỏng còn có một lớp màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolyaccharide gồm lipoprotein và lipopolysaccharide có bản chất là lipid. Lipid bị hòa tan trong cồn vì vậy trong bước rửa cồn, lớp màng ngoài bị tan ra nên vi khuẩn Gram âm bị mất màu tím, ở lần nhuộm tiếp lớp peptidoglycan bên trong sẽ bắt màu đỏ hồng của Fuchsin. Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iod bị giữ lại, khi quan sát trên kính hiển vi, vi khuẩn này có màu tím. Trong quá trình nhuộm, bước nhuộm tím tinh thể không nên để thời gian quá lâu, chất màu sẽ thấm vào lớp peptidoglycan bên trong, nên khi tẩy bằng cồn không thể làm sạch màu tím, dẫn đến việc Gram âm bắt màu như Gram dương.
Hình 3.4. Tế bào vi khuẩn G1 sau khi nhuộm Gram
3.1.3. Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn CT1.1 và G1
Thực hiện các phản ứng sinh hóa như thử nghiệm catalase, khả năng sử dụng các loại đường, khả năng sinh hơi của vi khuẩn.
Thử nghiệm catalase
Kết quả thử nghiệm catalase cho thấy, cả hai chủng CT1.1 và G1 đều có phản ứng dương tính khi nhỏ H2O2 vào sinh khối tế bào, hiện tượng sủi bọt khí xuất hiện chứng tỏ trong quá trình sinh trưởng hai chủng này có sinh enzyme catalase phân giải H2O2 thành H2O và O2. Vậy nên cả hai chủng CT1.1 và G1 đều là vi khuẩn hiếu khí.
Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng
Các chủng CT1.1 và G1 được nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường để lên men một trong các loại đường như mannitol, sorbitol, lactose, glucose, ở pH 7,4 và nhiệt độ 37oC. Kết quả quan sát cho thấy các chủng đều lên men đường glucose, manitol, lactose sinh acid làm giảm pH môi trường biến đổi màu chỉ thị phenol đỏ từ đỏ sang vàng và không lên men đường sorbitol. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.5 và Bảng 3.1.
Hình 3.5. Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng của chủng CT1.1
(1-Glucose, 2-Sorbitol , 3-Lactose, 4-Manitol, ĐC-Đối chứng)
Bảng 3.1. Khả năng lên men đƣờng của các chủng CT1.1 và G1
Chủng Loại đường CT1.1 G1 Glucose + + Sorbitol _ _ Lactose + + Mannitol + + Chú thích: +: dương tính -: âm tính
Đối với các loại đường là glucose, lactose, mannitol khả năng lên men của hai chủng CT1.1 và G1 là khác nhau, được biểu thị qua màu sắc môi trường sau khi lên men. Kết quả cho thấy ở chủng CT1.1 làm canh trường glucose chuyển sang màu cam đục và canh trường manitol, lactose có màu cam trong, với chủng G1 canh trường glucose và manitol có màu vàng trong, lactose có màu cam đục. Có sự khác nhau như vậy là do các sản phẩm (rượu, các acid hữu cơ, CO2) trong quá trình lên men sinh ra khác nhau về hàm lượng, tốc độ, làm pH môi trường cũng khác nhau nên chúng làm thay đổi màu chỉ thị khác nhau. Đối với loại đường còn lại là sorbitol, do không có enzyme phân giải nên kết quả lên men là âm tính vì vậy môi trường vẫn giữ nguyên màu đỏ ban đầu của môi trường lên men.
Thử nghiệm khả năng sinh hơi
Kết quả thử nghiệm khả năng sinh hơi khi nuôi cấy hai chủng CT1.1 và G1 trong môi trường lỏng TSB, pH = 7,0 ± 0,2 ở 37o
C cho thấy, cả hai chủng đều tạo khí bên trong ống durham, vậy cả hai chủng này sinh hơi trong quá trình lên men (Hình 3.6).
Hình 3.6. Thử nghiệm khả năng sinh hơi của chủng CT1.1 (A) và G1 (B) sau 24 giờ nuôi cấy
3.2. Định danh chủng CT1.1
Đoạn gen 16S rDNA chủng CT1.1 được tách chiết và tiến hành phản ứng PCR. Quy trình và nồng độ các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được nêu rõ ở trên. Kiểm tra điện di sản phẩm PCR của đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 cho kết quả dương tính với cặp mồi sử dụng. Sau đó, sản phẩm PCR của chủng này được giải trình tự.
Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Kết quả so sánh được trình bày trong Hình 3.7 và Bảng 3.2.
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen chủng CT1.1 1 TGCAAGTCGA GCGGTAACAG GAGAAAGCTT GCTTTCTTGC TGACGAGCGG 50 51 CGGACGGGTG AGTAATGTAT GGGGATCTGC CCGATAGAGG GGGATAACTA 100 101 CTGGAAACGG TGGCTAATAC CGCATGACGT CTACGGACCA AAGCAGGGGC 150 151 TCTTCGGACC TTGCGCTATC GGATGAACCC ATATGGGATT AGCTAGTAGG 200 201 TGGGGTAATG GCTCACCTAG GCGACGATCT CTAGCTGGTC TGAGAGGATG 250 251 ATCAGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC 300 301 AGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC CATGCCGCGT 350 351 GTATGAAGAA GGCCTTAGGG TTGTAAAGTA CTTTCAGCGG GGAGGAAGGT 400 401 GTTAAGATTA ATACTCTTAG CAATTGACGT TACCCGCAGA AGAAGCACCG 450 451 GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGGAGGGTGC AAGCGTTAAT 500 501 CGGAATTACT GGGCGTAAAG CGCACGCAGG CGGTCAATTA AGTCAGATGT 550 551 GAAAGCCCCG AGCTTAACTT GGGAATTGCA TCTGAAACTG GTTGGCTAGA 600 601 GTCTTGTAGA GGGGGGTAGA ATTCCACGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAG 650 651 ATGTGGAGGA ATACCGGTGG CGAAGGCGGC CCCCTGGACA AAGACTGACG 700 701 CTCAGGTGCG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC 750 751 CACGCTGTAA ACGATGTCGA TTTAGAGGTT GTGGTCTTGA ACCGTGGCTT 800 801 CTGGAGCTAA CGCGTTAAAT CGACCGCCTG GGGAGTACGG CCGCAAGGTT 850 851 AAAACTCAAA TGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT 900 901 TTAATTCGAT GCAACGCGAA GAACCTTACC TACTCTTGAC ATCCAGAGAA 950 951 TCCTTTAGAG ATAGAGGAGT GCCTTCGGGA ACTCTGAGAC AGGTGCTGCA 1000 1001 TGGCTGTCGT CAGCTCGTGT TGTGAAATGT TGGGTTAAGT CCCGCAACGA 1050 1051 GCGCAACCCT TATCCTTTGT TGCCAGCGCG TAATGGCGGG AACTCAAAGG 1100 1101 AGACTGCCGG TGATAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAGTCATCA 1150 1151 TGGCCCTTAC GAGTAGGGCT ACACACGTGC TACAATGGCA GATACAAAGA 1200 1201 GAAGCGACCT CGCGAGAGCA AGCGGAACTC ATAAAGTCTG TCGTAGTCCG 1250 1251 GATTGGAGTC TGCAACTCGA CTCCATGAAG TCGGAATCGC TAGTAATCGT 1300 1301 AGATCAGAAT GCTACGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC 1350 1351 GTCACACCAT GGGAGTGGGT TGCAAAAGAA GTAGGTAGCT TAACCTTCGG 1400 1401 GAGGGCGCT 1409
Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 với các trình tự tƣơng đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Accession Description Query
coverage
E value Max
ident NR_025336.1
Proteus vulgaris strain DSM 30118
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99%
NR_043998.1 Proteus penneri strain NCTC 12737
16S ribosomal RNA, partial sequence 95% 0.0 99%
NR_043997.1 Proteus mirabilis strain NCTC 11938
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99%
NR_043999.1
Proteus myxofaciens strain NCIMB 13273 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 98%
NR_043648.1 Xenorhabdus hominickii strain KE01
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 96%
Trình tự gen 16S rDNA của chủng CT1.1 tương đồng 99% với đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn Proteus vulgaris DSM 30118, Proteus penneri
NCTC 12737, Proteus mirabilis NCTC 11938. Kết quả này xác nhận chủng CT1.1 thuộc chi Proteus., để có thể định danh đến loài về chủng CT1.1 cần phải xác định thêm các đặc tính sinh hóa hoặc phép lai DNA – DNA.
3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 và G1
Các chủng CT1.1 và G1 được nuôi cấy trong môi trường TSB, pH 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng được lắc với tốc độ 180 vòng/phút để xây dựng đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3, 3.4, Hình 3.8 và 3.9.
Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng CT1.1 theo thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Giá trị OD600 Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình D-d (mm) 0 0,06 - 1 0,25 - 2 0,55 8