Máy ly tâm ( Eppendorf Centrifuge 5417R, Mỹ) Tủ lạnh (NANO Silver, Việt Nam)
Kính hiển vi 3 mắt ngắm có camera và máy tính (Motic BA 300, Mỹ) Máy lắc (GFL 3005, Đức)
Tủ cấy (Telstar AV 100, OSI Co, Ltd, Tây Ban Nha) Tủ sấy (Binder, Đức)
Nồi khử trùng autoclave (Sturdy industrial Co, Ltd, Đài Loan) Lò vi sóng phá mẫu (LG, Hàn Quốc).
2.1.4. Hóa chất, môi trƣờng và thuốc thử
Môi trƣờng nuôi cấy TSB
Trypticase pepton 17 g Phytone pepton 3 g NaCl 5 g K2HPO4 2,5 g Glucose 2,5 g Nước cất 1 lít pH 7,3 ± 0,2
Hòa tan 30g môi trường TSB tổng hợp trong 1000 ml nước cất, chuẩn pH, sau đó đem rót môi trường vào các bình tam giác, làm nút bông và giấy bạc, hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 15 phút.
Môi trƣờng thử hoạt tính TSA
Môi trường TSA được pha từ môi trường TSB có bổ sung thêm thạch agar, nồng độ agar bổ sung từ 1÷1,5%. Hấp khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 15 phút.
Môi trƣờng lên men đƣờng (Môi trƣờng cơ bản)
Pepton 10g NaCl 30g Cao thịt bò 3g Phenol đỏ 0,04g Nước cất 1 lít pH 7,0 ± 0,2
Hoà tan các thành phần trên, bổ sung lượng đường cần thiết sao cho môi trường cuối cùng có nồng độ đường là 5%. Hấp khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút.
Thuốc nhuộm Tím Violet
Tím violet 1 g
Rượu ethylic 1 g
Phenol tinh thể 2 g
Pha chế:
Hòa tan 1g tím violet vào trong 10 ml cồn (dung dịch 1) Hòa tan 2 g phenol tinh thể vào 10 ml nước cất (dung dịch 2)
Trộn chung dung dịch 1 và dung dịch 2 lại với nhau ta có dung dịch thuốc nhuộm tím violet.
Thuốc nhuộm Liugol
Iod tinh thể 1 g
KI 2 g
Nước cất 200 ml
Pha chế: Hòa tan iod vào nước cất, sau đó cho KI vào. Bảo quản trong lọ tối màu.
Thuốc nhuộm Fuchsin
Fuchsin kiềm 1 g
Rượu ethylic 95% 10 ml
Phenol tinh thể 5 g
Nước cất 100 ml
Pha chế:
Hòa tan Fuchsin vào trong 10 ml cồn 95% (dung dịch 1). Hòa tan phenol tinh thể vào 100 ml nước cất (dung dịch 2).
Trộn đều dung dịch 1 và dung dịch 2 đem lọc, ta có thuốc nhuộm Fuchsin.
2.2. Quy trình thực hiện
Quy trình thực hiện được sơ đồ hóa theo hình dưới đây:
Chủng vi khuẩn sinh bacteriocin Quan sát hình thái tế bào - nhuộm Gram Test hóa sinh Đặc điểm sinh học
Xác định khả năng sinh trưởng Xác định khả năng sinh bacteriocin
Xác định tính chất của dịch bacteriocin thô
Xác định độ bền với enzyme proteinase K và trypsin Xác định độ bền với nhiệt độ Xác định độ bền với pH Cơ chế kháng khuẩn Định danh vi khuẩn
2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn sinh bacteriocin 2.3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 2.3.1.1. Quan sát đặc điểm, hình thái khuẩn lạc
Quan sát và mô tả hình dạng kích thước và màu sắc khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn, sử dụng phương pháp cấy ria và cấy điểm chủng vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa tương ứng.
Tiến hành: Hoạt hóa chủng vi khuẩn gốc được giữ trong glycerin bằng cách hút 1ml dịch vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường TSB, ở điều kiện 37oC trong 16÷24 giờ. Dùng que cấy ria, lấy một vòng dịch vi khuẩn đã hoạt hóa cấy ria và cấy điểm trên môi trường thạch đĩa TSA, nuôi cấy ở điều kiện như trên. Quan sát kết quả sau 18÷24 giờ.
2.3.1.2. Nhuộm Gram Nguyên tắc: Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn Gram dương và Gram âm được quy định bởi cấu trúc thành tế bào mà tiến hành nhuộm Gram để xác định các chủng vi khuẩn phân lập được thuộc loại nào. Tiến hành quan sát bằng kính hiển vi các chủng để xác định hình dạng tế bào và khả năng bắt màu qua phương pháp nhuộm Gram đối với các chủng vi khuẩn.
Tiến hành:
o Nhỏ 1 giọt nước từ bình tia lên bề mặt lam kính.
o Dùng que cấy thu sinh khối từ khuẩn lạc chọn lọc, rồi đưa vào lam kính, dàn đều vi khuẩn, để khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn cồn.
o Nhỏ vài giọt tím tinh thể (tím violet) lên tiêu bản, để trong 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước.
o Nhuộm màu tiêu bản bằng thuốc nhuộm Lugol trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa nhẹ với nước bằng bình tia.
o Rửa tiêu bản vừa nhuộm với cồn 90o
trong khoảng 10÷15 giây, rồi rửa lại với nước.
o Nhuộm tiếp tiêu bản với Fuchsin trong thời gian 30 giây đến 1 phút, rồi rửa lại với nước.
o Để khô tự nhiên hoặc dung giấy thấm lau tiêu bản cho sạch xung quanh vùng vi khuẩn, sau đó đưa lên vật kính dầu X -100 để quan sát.
2.3.2. Định danh vi khuẩn Tách chiết DNA hệ gen Tách chiết DNA hệ gen
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSB ở nhiệt độ 37o
C trong 24 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC để thu tế bào (Luan và cộng sự, 2007). DNA tổng số được tách chiết bằng bộ kit Wizard® SV Genomic DNA System (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sau đó bảo quản ở -20o
C.
Xác định gen 16S rDNA bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi tương ứng được tổng hợp bởi IDT (Mỹ) có trình tự như sau:
16S-27F 5'AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3' 16S-1492R 5'ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT 3'
Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 µl với các thành phần ở nồng độ cuối cùng như sau: DNA (2-20 ng), mỗi mồi (0,1 µM), dNTP (0,1 mM mỗi loại), MgCl2 (2 mM), Taq polymerase (1,25 U) và đệm Tag (1X). Chu kì nhiệt của phản ứng bao gồm biến tính ban đầu ở 94oC trong 3 phút; 35 chu kì của 94o
C trong 1 phút, 50oC trong 1 phút và 72oC trong 1 phút; và cuối cùng kết thúc ở 72o
C trong 7 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1-1,5% trong đệm TBE 0,5X, sau đó được nhuộm với ethidium bromide và đọc kết quả trên máy chụp ảnh gel (Biorad).
Giải và phân tích trình tự
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PCR clean up system (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye Terminator v. 3.1, Applied Biosystems) với các cặp mồi 16S-27F/16S-1492R theo chương trình
nhiệt như sau: 96°C trong 20 giây, 50°C trong 20 giây và 60°C trong 4 phút. Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems).
Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
2.3.3. Xác định khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn Mục đích:
o Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn o Test sinh hóa
o Giữ giống
Nguyên lý:
Khả năng sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 600 nm. Dựa vào đường chuẩn để xác định các pha sinh trưởng của vi khuẩn, từ đó tiến hành các bước giữ giống, test sinh hóa cho đúng với các giai đoạn phát triển của tế bào.
Tiến hành:
o Pha môi trường nuôi cấy TSB, hấp khử trùng môi trường. o Cấy chủng vi khuẩn đã chọn lọc vào môi trường.
o Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên máy lắc ở 180 vòng/phút trong vòng 12÷16 giờ.
o Tiến hành đo OD600 ban đầu (khoảng OD600 ban đầu được dùng để chuyển sang nuôi cấy lần 2 tốt nhất là vào khoảng 1÷2). Đưa giá trị OD600 của dịch nuôi cấy lần 2 về giá trị 0,06.
o Tiến hành đo OD600 từ lúc cấy vào và cứ mỗi 30 phút đo một lần. o Dựng đường cong sinh trưởng.
2.3.4. Xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 2.3.4.1. Thử nghiệm catalase 2.3.4.1. Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc:
Vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các chủng Streptococcus spp.). Enzyme này có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2 tạo nên hiện tượng sủi bọt khí.
Tiến hành:
o Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiến kính sạch. Nhỏ một giọt 3% H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có.
o Thử nghiệm là (+) khi có hiện tượng sủi bọt khí do O2 tạo ra, ngược lại là (-) khi không có sủi bọt khí.
2.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men các loại đƣờng Mục đích:
Kiểm tra khả năng lên men các loại đường glucose, sorbitol, lactose, manitol của vi khuẩn.
Nguyên lý:
Quá trình lên men đường có thể sinh ra các loại acid hữu cơ, các loại rượu hay các loại khí, các sản phẩm này sẽ làm thay đổi pH môi trường. Dựa vào sự thay đổi màu của chỉ thị để đánh giá khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn.
Tiến hành:
o Pha môi trường cơ bản có bổ sung riêng từng loại đường: glucose, sorbitol, lactose, manitol trong nước cất, sao cho môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrate là 5%.
o Rót môi trường vào ống nghiệm, đậy nút bông và giấy bạc cho kín, đem hấp khử trùng 121o
o Môi trường cơ bản chứa chất chỉ thị là phenol đỏ, chất này có màu đỏ khi pH nằm trong khoảng 7,4 ± 0,2. Màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH dưới 6,8.
o Dùng que cấy vô trùng thu sinh khối khuẩn lạc các chủng, cấy vào các ống nghiệm môi trường chứa các loại đường.
o Ủ các ống nghiệm đã cấy trong tủ ấm 37o
C. Quan sát trong 5 ngày. o Các thao tác vi sinh được làm vô trùng trong tủ cấy vô trùng, bên cạnh
ngọn đèn cồn.
2.3.4.3. Thử nghiệm khả năng sinh hơi Tiến hành: Tiến hành:
Chuẩn bị ống nghiệm sạch và ống Durham, cho vào mỗi ống 10 ml môi trường TSB, nhẹ nhàng cho ống Durham vào trong các ống nghiệm chứa môi trường sao cho môi trường ngập trong ống và không có không khí bên trong ống. Bao kín các ống nghiệm bằng nút bông, giấy bạc, đem hấp khử trùng môi trường ở 121oC trong 15 phút.
Cấy dịch vi khuẩn cần thử nghiệm vào các ống môi trường đã chuẩn bị ở trên, đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24÷48 giờ. Tất cả các thao tác phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Quan sát các ống nghiệm đã được ủ xác nhận các ống dương tính đó là xuất hiện không khí bên trong ống Durham và sẽ nổi lên phía trên của ống nghiệm.
2.3.5. Xác định khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn
Mục đích: Xác định thời điểm vi khuẩn sinh bacteriocin cực đại, tiến hành thu dịch bacteriocin thô.
Tiến hành:
o Thực hiện đồng thời với quá trình xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn. Sau thời gian 30 phút thu dịch nuôi cấy một lần, ly tâm thu dịch nuôi cấy ở điều kiện 6000vòng/phút, 30 phút, 5o
C, chỉnh pH về giá trị 7 bằng dung dịch NaOH 2N hoặc HCl 3N, đây được coi là dịch bacteriocin thô.
o Xác định khả năng sinh bacterioicin của vi khuẩn thông qua đường kính vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của vi sinh vật kiểm định và vi sinh vật chỉ thị.
o Đổ 20 ml môi trường TSA vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông. Trải 100 μl dịch nuôi cấy qua đêm của chủng chỉ thị Bacillus sp. B1.1 với mật độ 106÷108 CFU/ml. Đục lỗ có đường kính 5 mm trên đĩa thạch, nhỏ 70 μl dịch bacteriocin thô vào lỗ thạch. Ủ đĩa ở 37oC, 12÷16 giờ. Kiểm tra sự tạo thành vòng kháng và đo đường kính các vòng kháng khuẩn.
Hình 2.1. Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri
o Đường kính vòng kháng khuẩn được tính như sau:
Trong đó:
dkk: đường kính vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch d: đường kính lỗ thạch
D: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ thạch) o Xây dựng đường cong sinh bacteriocin dựa vào đường kính vòng
kháng theo thời gian nuôi cấy.
2.3.6. Xác định một số tính chất của dịch bacteriocin 2.3.6.1. Thử với enzyme proteinase K và trypsin 2.3.6.1. Thử với enzyme proteinase K và trypsin
Mục đích: Để kiểm tra bản chất của chất kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra có
phải là protein hay không.
Nguyên lý: Bacteriocin có bản chất protein nên dưới tác dụng của các enzyme thủy phân proteinase K, enzyme α-chymotrypsin và một số enzyme khác như trypsin sẽ làm bacteriocin bị thủy phân, mất tính kháng với các chủng vi khuẩn chỉ thị.
Tiến hành:
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn sinh bacteriocin, thu dịch nuôi cấy ở thời điểm vi khuẩn sinh bacteriocin cực đại (đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất). Ly tâm dịch ở điều kiện 6000 vòng/phút, 30 phút, 5o
C, thu dịch nổi, chuẩn độ pH của dịch về giá trị 7 bằng dung dịch NaOH 2N hoặc bằng HCl 3N. Dịch này được coi là dịch bacteriocin thô.
Trước tiên xử lý dịch thô bằng enzyme catalase sao cho tỉ lệ enzyme/dịch thô đạt nồng độ cuối cùng là 1mg/ml, thời gian xử lý 30 phút, ở nhiệt độ phòng. Bước này có mục đích loại đi ảnh hưởng của H2O2 tới khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin. Dịch thô sau khi được xử lý với enzyme cactalase được chia làm ba mẫu:
Mẫu thứ nhất đem xử lý với enzyme trypsin Mẫu thứ hai đem xử lý với enzyme proteinase K Mẫu còn lại sử dụng làm mẫu đối chứng dương
Với hai loại enzyme proteinase K và trypsin (đã được pha sẵn trước đó với nồng độ 20 mg/ml) sẽ được bổ sung vào dịch bacteriocin sao cho tỷ lệ enzyme/dịch bacteriocin thô của vi khuẩn phải đạt nồng độ cuối cùng là 1mg/1ml. Đem ủ trong tủ ấm 37oC, mẫu xử lý proteinase ủ trong 3 giờ và mẫu xử lý trypsin ủ trong 6 giờ, sau đó đem bất hoạt enzyme ở 80o
C trong vòng 15 phút.
Sau khi xử lý enzyme, kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Đổ 20 ml môi
trường TSA vào đĩa petri vô trùng, để thạch đông, trải 100 μl dịch nuôi cấy qua đêm của chủng chỉ thị Bacillus sp. B1.1 hoặc Vibrio sp. C1. Đục lỗ có đường kính 5 mm trên đĩa thạch, nhỏ 70 μl dịch thô ở trên vào lỗ thạch, ủ đĩa ở 37o
C, 12÷16 giờ và kiểm tra sự tạo thành vòng kháng và đo đường kính các vòng kháng khuẩn.
2.3.6.2. Xác định độ bền với nhiệt độ của dịch bacteriocin Mục đích: Mục đích:
Khảo sát khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin thô do vi khuẩn sinh ra ở những thang nhiệt độ khác nhau, từ đó giúp cho việc nuôi cấy, thu dịch bacteriocin hiệu quả hơn, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất và bảo quản chế phẩm probiotic sau này.
Nguyên lý:
Bacteriocin có bản chất là protein, khi bị tác động bởi nhiệt độ hoạt tính của dịch có thể bị giảm hoặc mất đi do cấu trúc của protein bị biến đổi. Mức độ ảnh hưởng đến hoạt tính của dịch bacteriocin tùy theo nhiệt độ và thời gian xử lý nhiệt.
Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn và tiến hành thu dịch bacteriocin thô (các thao tác thu hồi dịch đã nêu trước đó), chuẩn độ pH về giá trị 7. Hút lần lượt ra các ống nghiệm đã sấy tiệt trùng, mỗi ống nghiệm 5 ml đem đi xử lý ở các nhiệt độ sau: 60oC, 100oC bằng cách ủ ở bể ổn nhiệt (xử lý ở các mức thời gian 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút) và 121oC ở nồi hấp trong vòng 15 phút.
Mẫu đối chứng dương là dịch bacteriocin thô không xử lý nhiệt, để ở nhiệt độ phòng và mẫu đối chứng âm là môi trường TSB.
Sau khi xử lý nhiệt độ, kết quả được kiểm tra dựa trên kích thước vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị là Bacillus sp. B1.1 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (đã trình bày rõ ở trên).
2.3.6.3. Xác định độ bền với pH của dịch bacteriocin Mục đích: