Đoạn gen 16S rDNA chủng CT1.1 được tách chiết và tiến hành phản ứng PCR. Quy trình và nồng độ các hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR được nêu rõ ở trên. Kiểm tra điện di sản phẩm PCR của đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 cho kết quả dương tính với cặp mồi sử dụng. Sau đó, sản phẩm PCR của chủng này được giải trình tự.
Các trình tự được phân tích, chỉnh sửa bằng phần mềm BioEdit 7.1.3.0 và Genious Pro 5.5.7, và được so sánh với các trình tự nucleotide tương đồng trên Genbank bằng chương trình BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Kết quả so sánh được trình bày trong Hình 3.7 và Bảng 3.2.
Hình 3.7. Kết quả giải trình tự gen chủng CT1.1 1 TGCAAGTCGA GCGGTAACAG GAGAAAGCTT GCTTTCTTGC TGACGAGCGG 50 51 CGGACGGGTG AGTAATGTAT GGGGATCTGC CCGATAGAGG GGGATAACTA 100 101 CTGGAAACGG TGGCTAATAC CGCATGACGT CTACGGACCA AAGCAGGGGC 150 151 TCTTCGGACC TTGCGCTATC GGATGAACCC ATATGGGATT AGCTAGTAGG 200 201 TGGGGTAATG GCTCACCTAG GCGACGATCT CTAGCTGGTC TGAGAGGATG 250 251 ATCAGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC 300 301 AGTGGGGAAT ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC CATGCCGCGT 350 351 GTATGAAGAA GGCCTTAGGG TTGTAAAGTA CTTTCAGCGG GGAGGAAGGT 400 401 GTTAAGATTA ATACTCTTAG CAATTGACGT TACCCGCAGA AGAAGCACCG 450 451 GCTAACTCCG TGCCAGCAGC CGCGGTAATA CGGAGGGTGC AAGCGTTAAT 500 501 CGGAATTACT GGGCGTAAAG CGCACGCAGG CGGTCAATTA AGTCAGATGT 550 551 GAAAGCCCCG AGCTTAACTT GGGAATTGCA TCTGAAACTG GTTGGCTAGA 600 601 GTCTTGTAGA GGGGGGTAGA ATTCCACGTG TAGCGGTGAA ATGCGTAGAG 650 651 ATGTGGAGGA ATACCGGTGG CGAAGGCGGC CCCCTGGACA AAGACTGACG 700 701 CTCAGGTGCG AAAGCGTGGG GAGCAAACAG GATTAGATAC CCTGGTAGTC 750 751 CACGCTGTAA ACGATGTCGA TTTAGAGGTT GTGGTCTTGA ACCGTGGCTT 800 801 CTGGAGCTAA CGCGTTAAAT CGACCGCCTG GGGAGTACGG CCGCAAGGTT 850 851 AAAACTCAAA TGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT 900 901 TTAATTCGAT GCAACGCGAA GAACCTTACC TACTCTTGAC ATCCAGAGAA 950 951 TCCTTTAGAG ATAGAGGAGT GCCTTCGGGA ACTCTGAGAC AGGTGCTGCA 1000 1001 TGGCTGTCGT CAGCTCGTGT TGTGAAATGT TGGGTTAAGT CCCGCAACGA 1050 1051 GCGCAACCCT TATCCTTTGT TGCCAGCGCG TAATGGCGGG AACTCAAAGG 1100 1101 AGACTGCCGG TGATAAACCG GAGGAAGGTG GGGATGACGT CAAGTCATCA 1150 1151 TGGCCCTTAC GAGTAGGGCT ACACACGTGC TACAATGGCA GATACAAAGA 1200 1201 GAAGCGACCT CGCGAGAGCA AGCGGAACTC ATAAAGTCTG TCGTAGTCCG 1250 1251 GATTGGAGTC TGCAACTCGA CTCCATGAAG TCGGAATCGC TAGTAATCGT 1300 1301 AGATCAGAAT GCTACGGTGA ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC 1350 1351 GTCACACCAT GGGAGTGGGT TGCAAAAGAA GTAGGTAGCT TAACCTTCGG 1400 1401 GAGGGCGCT 1409
Bảng 3.2. So sánh trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng CT1.1 với các trình tự tƣơng đồng trên Genbank bằng công cụ BLAST
Accession Description Query
coverage
E value Max
ident NR_025336.1
Proteus vulgaris strain DSM 30118
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99%
NR_043998.1 Proteus penneri strain NCTC 12737
16S ribosomal RNA, partial sequence 95% 0.0 99%
NR_043997.1 Proteus mirabilis strain NCTC 11938
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 99%
NR_043999.1
Proteus myxofaciens strain NCIMB 13273 16S ribosomal RNA, partial sequence
100% 0.0 98%
NR_043648.1 Xenorhabdus hominickii strain KE01
16S ribosomal RNA, partial sequence 100% 0.0 96%
Trình tự gen 16S rDNA của chủng CT1.1 tương đồng 99% với đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn Proteus vulgaris DSM 30118, Proteus penneri
NCTC 12737, Proteus mirabilis NCTC 11938. Kết quả này xác nhận chủng CT1.1 thuộc chi Proteus., để có thể định danh đến loài về chủng CT1.1 cần phải xác định thêm các đặc tính sinh hóa hoặc phép lai DNA – DNA.
3.3. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 và G1
Các chủng CT1.1 và G1 được nuôi cấy trong môi trường TSB, pH 7,0 ± 0,2 ở nhiệt độ phòng được lắc với tốc độ 180 vòng/phút để xây dựng đường cong sinh trưởng và sinh bacteriocin. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.3, 3.4, Hình 3.8 và 3.9.
Bảng 3.3. Kết quả xác định khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng CT1.1 theo thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy (giờ)
Giá trị OD600 Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình D-d (mm) 0 0,06 - 1 0,25 - 2 0,55 8 3 1,20 8,67 4 1,46 9,67 4,5 1,53 11,33 5 1,57 12,67 5,5 1,62 14,33 6 1,65 9,33 6,5 1,71 8,33 7 1,73 6,67 24 2,01 - 27 1,73 - Chú thích: - : không khảo sát
Hình 3.8. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng CT1.1 nuôi trên môi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 180 vòng/phút
Bảng 3.4. Kết quả xác định khả năng sinh trƣởng (OD600) và sản sinh bacteriocin của chủng G1
Thời gian nuôi cấy (giờ) Giá trị OD600 Đường kính vòng kháng khuẩn D-d (mm) 0 0,06 - 1 0,10 - 2 0,25 10 3 0,73 11 4 1,41 11,75 4,5 1,45 13 5 1,49 13 5,5 1,52 14,25 6 1,55 13 6,5 1,59 12 7 1,63 11 27 1,82 - 29 1,65 - Chú thích: - : không khảo sát
Hình 3.9. Đƣờng cong sinh trƣởng và sinh bacteriocin của chủng G1 nuôi trên môi trƣờng TSB, ở pH 7 ± 0,2, nhiệt độ phòng và lắc ở 180 vòng/phút
Tiến hành khảo sát các chủng trong 30 giờ nuôi cấy kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tạo nên đường cong sinh trưởng điển hình với 4 pha sinh trưởng là pha lag, pha logarit, pha cân bằng và pha suy vong. Các chủng CT1.1, G1 được hoạt hóa qua đêm và cấy chuyền sang môi trường mới với mật độ tế bào thấp (OD600= 0,06). Đây là giai đoạn đầu của pha lag, lúc này do mới cấy chuyển sang môi trường mới nên các chủng vi khuẩn phải thích nghi và làm quen với môi trường, sau đó mới cảm ứng và sinh ra các loại enzyme phân giải thành phần môi trường. Vì vậy ở pha lag này, mật độ tế bào tăng rất chậm sau 1 giờ nuôi cấy chủng CT1.1 có OD600 tăng lên 0,25 và chủng G1 tăng lên 0,1. Thời gian pha lag của chủng G1 kéo dài hơn so với chủng CT1.1.
Đến pha log, mật độ tế bào tăng đột ngột vì các enzyme phân giải môi trường đã sẵn có, dinh dưỡng môi trường giàu và ổn định nên các thành phần môi trường được tổng hợp với tốc độ đều và quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất. Số lượng tế bào tăng theo lũy thừa, thời gian thế hệ đạt tới hằng số. Ở pha này OD600 tăng liên tục và rất nhanh, sau 4,5 giờ nuôi cấy OD600 tăng lên đến 1,53 đối với chủng CT1.1 và 1,45 đối với chủng G1. So sánh hai chủng CT1.1 và G1 ta thấy, thời gian pha lag của chủng G1 kéo dài hơn chủng CT1.1 nhưng đến pha log tốc độ phát triển nhanh, rút ngắn thời gian pha log và bắt đầu phát triển chậm lại đạt đến pha cân bằng sau 4 giờ nuôi cấy, trước chủng CT1.1 sau 4,5 giờ nuôi cấy.
Bacteriocin có bản chất là một protein do gen mã hóa, sự tổng hợp xảy ra cùng với quá trình sinh trưởng của tế bào. Khảo sát quá trình sinh bacteriocin tiến hành khi sự phát triển của các chủng CT1.1 và G1 bắt đầu ở pha log. Sau 1,5 giờ nuôi cấy, đường kính vòng kháng khuẩn do dịch bacteriocin thô kháng vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1 của chủng CT1.1 là 7 mm, với chủng G1 là 9,75 mm. Vì ở đầu pha log, vi khuẩn mới qua giai đoạn thích nghi với môi trường, quá trình trao đổi chất diễn ra chậm, số lượng tế bào còn ít, lượng bacteriocin được sinh ra không nhiều. Tuy nhiên lượng bacteriocin sinh ra tăng đều theo thời gian nuôi cấy, ở thời điểm kết thúc pha log, đường kính vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin sinh bởi chủng CT1.1 tăng lên đến 11,33 mm, với chủng G1 là 11,75 mm và có xu hướng tăng đến pha cân bằng.
Bước sang giai đoạn cân bằng thì tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng trao đổi chất giảm, số lượng tế bào chết cân bằng với số tế bào sinh ra. Một số nguyên nhân khiến vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm, các chất độc tích lũy, pH thay đổi...Theo số liệu đo được, OD600 ở pha cân bằng cao hơn so với các pha khác, độ đục này có thể vừa bao gồm sinh khối, xác tế bào và cả sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn. Chủng CT1.1 có OD600 cao nhất đạt 2,01 sau 24 giờ nuôi cấy và với chủng G1 là 1,82 sau 27 giờ nuôi cấy. Ta thấy thời gian pha cân bằng của chủng CT1.1 ngắn hơn so với chủng CT1.1 là 3 giờ và bắt đầu chuyển sang pha suy vong sau 24 giờ nuôi cấy.
Ở đầu giai đoạn này lượng bacteriocin sinh ra vẫn tăng lên, lượng bacteriocin tăng lên cực đại sau 5,5 giờ nuôi cấy với cả hai chủng CT1.1 và G1 khi giá trị OD600 lần lượt là 1,62 và 1,52, đường kính vòng kháng khuẩn của dịch bacteriocin sinh bởi chủng CT1.1 đo được ở thời điểm này là 14,33 mm, với chủng G1 là 14,25 mm. Tuy nhiên, đến giữa và cuối pha cân bằng lượng bacteriocin sinh ra giảm dần đối với chủng G1 và với chủng CT1.1 lại giảm mạnh. Sau 7 giờ nuôi cấy đường kính vòng kháng đo được là 6,67 mm với chủng CT1.1 và 10,5 mm với chủng G1. Đến cuối pha cân bằng, môi trường gần hết dinh dưỡng, chất độc tích lũy nhiều ức chế sự sinh trưởng của tế bào, lượng tế bào chết tăng nhiều đồng thời phóng thích ra môi trường một lượng lớn enzyme protease, bacteriocin với bản chất là protein sẽ bị phân giải. Do vậy lượng bacteriocin sinh ra giảm đi nhiều.
Tiếp tục nuôi cấy, tiến hành đo OD600 thấy rằng giá trị bắt đầu giảm, sau 27 giờ nuôi cấy OD600 của chủng CT1.1 giảm còn 1,73, với chủng G1 OD600 sau 29 giờ nuôi cấy giảm còn 1,65. Điều này cho thấy các chủng vi khuẩn đã đến giai đoạn suy vong, vi khuẩn chứa các enzyme tự phân giải tế bào, môi trường hết chất dinh dưỡng… vì vậy vi khuẩn không tổng hợp các thành phần tế bào, các quá trình đình trệ và chúng bị chết.
Như vậy các đối với các chủng CT1.1 và G1, ở đầu giai đoạn cân bằng (sau 5,5 giờ nuôi cấy, OD600 đạt lần lượt là 1,62 và 1,52) thì lượng bacteriocin được tổng hợp cực đại, đây là giai đoạn thích hợp nhất để thu dịch bactriocin thô tiến hành xác định các tính chất của dịch cũng như quá trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin.
Hoạt độ dịch bacteriocin của các chủng CT1.1 và G1
Hoạt độ của dịch bacteriocin của các chủng CT1.1 và G1 được xác định bằng phương pháp pha loãng ở dải nồng độ gấp hai lần liên tiếp, xác định nồng độ pha loãng cao nhất còn thấy vòng kháng khuẩn.
Hình 3.10. Hoạt tính kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh bởi chủng G1 ở những nồng độ pha loãng khác nhau
Kết quả cho thấy, dịch bacteriocin của cả hai chủng CT1.1 và G1 ở độ pha loãng cao nhất, pha loãng 128 lần, vẫn còn thấy được vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1.
Bảng 3.5.Đƣờng kính vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 ở các độ pha loãng khác nhau
Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm) Đối chứng
Độ pha loãng của dịch bacteriocin đã được trung hòa pH
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
CT1.1 0 11,5 9,0 7,5 6,5 5,0 4,0 3,0
Theo công thức tính hoạt độ bacteriocin (AU/ml) ta có: AU/mlG1 = AU/mlCT1.1 = 128x1000/70 = 1828
Vậy hoạt độ dịch bacteriocin thô của chủng CT1.1 và G1 là 1828 AU/ml.
3.4. Một số tính chất của dịch bacteriocin thô của các chủng CT1.1 và G1 3.4.1. Kết quả thử độ bền với enzyme proteinase K và enzyme trypsin 3.4.1. Kết quả thử độ bền với enzyme proteinase K và enzyme trypsin
Tiến hành kiểm tra dịch bacteriocin của chủng CT1.1 và G1 với enzyme proteinase K và trypsin để khẳng định bản chất của chất kháng khuẩn do vi khuẩn sinh ra có phải là bacteriocin hay không. Trong quy trình xử lý, các mẫu đều được chỉnh về pH 7 bằng dung dịch NaOH 2N và HCl 3N và xử lý enzyme catalase để loại trừ ảnh hưởng của acid hữu cơ và H2O2 đến khả năng kháng khuẩn.
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng CT1.1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trƣờng thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Vibrio sp.C1
Kết quả kiểm tra cho thấy, dịch bacteriocin của cả hai chủng CT1.1 và G1 bị mất hoàn toàn khả năng kháng khuẩn khi xử lý với hai loại enzyme proteinase K và trypsin, trong khi đó, mẫu đối chứng là dịch bacteriocin thô vẫn tạo nên vòng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1 và Vibrio sp. C1 (Hình 3.11 và 3.12). Proteinase K và trypsin là hai enzyme thủy phân protein, dịch thô mất hoạt tính kháng khuẩn chứng tỏ chất kháng khuẩn có chứa thành phần cấu trúc không bền với enzyme thủy phân protein.
Hình 3.12. Kết quả kiểm tra dịch bacteriocin của chủng G1 với enzyme proteinase K và trypsin trên môi trƣờng thạch TSA, vi khuẩn chỉ thị Bacillus sp. B1.1
3.4.2. Độ bền nhiệt độ của dịch bacteriocin thô
Sau khi xác định được bản chất của chất kháng khuẩn do các chủng CT1.1 và G1 sinh là là bacteriocin, tiến hành khảo sát một số tính chất của dịch bacteriocin. Dịch bacteriocin của hai chủng CT1.1 và G1 được kiểm tra ở các nhiệt độ khác nhau với mức thời gian khác nhau để xác định khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin thô.
Kết quả thu được cho thấy, hoạt tính bacteriocin của chủng G1 bền hơn so với của chủng CT1.1. Dịch bacteriocin của chủng G1 còn giữ được 46,2% hoạt tính kháng khuẩn sau khi xử lý ở 60oC(45 phút) và 30,8% hoạt tính ở 100oC(30 phút). Với chủng CT1.1 dịch bacteriocin còn giữ được 28,6% hoạt tính kháng khuẩn ở 60oC(45 phút), và 57,1% hoạt tính ở 100oC(15 phút), ở 121oC dịch thô bị mất hoàn toàn hoạt tính.
Bảng 3.6. Đƣờng kính vòng kháng và khả năng kháng Bacillussp. B1.1 còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý nhiệt độ
Chủng vi khuẩn Đối chứng âm Nhiệt độ xử lý 30oC 60oC 30’ 60oC 45’ 100oC 15’ 100oC 30’ 121oC 15’ Đường kính vòng kháng (D-d, mm) CT1.1 0 14 10 4 8 0 0 G1 0 13 11 6 9 4 0 Khả năng kháng (%) CT1.1 100 71,4 28,6 57,1 0 0 G1 100 84,6 46,2 69,2 30,8 0
%: hoạt tính kháng của dịch bacteriocin sinh từ các chủng CT1.1 và G1 khi để ở nhiệt độ phòng (ở 30o
C) được coi là 100%
Hình 3.13. Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý 30 phút ở các nhiệt độ khác nhau
(M1: đối chứng âm, môi trường TSB; M2: dịch bacteriocin xử lý ở nhiệt độ phòng, M3: dịch bacteriocin xử lý ở 60oC, 30 phút; M4: dịch bacteriocin xử lý 100oC, 30 phút; M5: dịch bacteriocin xử lý ở 121oC trong 15 phút)
Qua đây ta thấy, khả năng bền nhiệt của dịch bacteriocin sinh từ hai chủng CT1.1 và G1 không cao. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch bacteriocin bị ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ, để định hướng ứng dụng bacteriocin trong sản xuất chế phẩm probiotic cần tối ưu nhiệt độ trong nuôi cấy thu nhận, sản xuất bacteriocin.
3.4.3. Độ bền pH của dịch bacteriocin thô
pH là yếu tố được biết đến có ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính của các bacteriocin, các bacteriocin khác nhau thì thường có dải pH hoạt động cũng rất đa dạng. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính dịch bacteriocin của hai chủng CT1.1 và G1 được kiểm tra ở các giá trị pH 2, 4, 6, 7, 8 , 10 ,12 sau 20 phút xử lý. Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.7, Hình 3.14 và 3.15.
Bảng 3.7. Đƣờng kính vòng kháng Bacillus sp.B1.1 và khả năng kháng còn lại của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 và G1 sau khi xử lý pH
Đối chứng Giá trị pH 2 4 6 7 8 10 12 Đường kính vòng kháng (D-d, mm) CT1.1 0 0 4 11 13 12 6 0 G1 0 4 8 13.5 14 13 7,5 0 Khả năng kháng (%) CT1.1 0 30,7 84,6 100 92,3 46,2 0 G1 28,6 57,1 96,4 100 92,9 53,6 0
%: hoạt tính bacteriocin của các chủng CT1.1 và G1 khi ở pH 7 được coi là 100%
Hình 3.14 . Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng CT1.1 sau khi xử lý ở pH 2÷12
(ở pH = 4 vòng kháng hơi mờ không nhìn thấy rõ trên hình)
Theo kết quả Bảng 3.7 và Hình 3.14 ta thấy dịch bacteriocin của vi khuẩn CT1.1 bền trong dải pH từ 4÷10, tuy nhiên ở pH 4 và 10 hoạt tính kháng khuẩn đã giảm đáng kể, ở pH 4 dịch bacteriocin giữ được 30,7% hoạt tính và pH 10 còn 46,2% . Ở giá trị pH 2 và 12 dịch bacteriocin không bền và mất hoàn toàn hoạt tính kháng khuẩn, tại lỗ thạch không xuất hiện vòng kháng khuẩn giống với mẫu đối chứng là môi trường TSB.
Hình 3.15. Vòng kháng Bacillus sp.B1.1 của dịch bacteriocin sinh từ chủng G1