- Chỉ tiêu theo dõi:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THAỎ LUẬN
3.4.1. Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn (OD600nm) ựến tỉ lệ biểu hiện tạm thời của gen Gus
gen Gus
Một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn ựến hiệu quả biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium chắnh là mật độ của vi khuẩn khi lây nhiễm. Mật ựộ vi khuẩn thể hiện số tế bào vi khuẩn trong một ựơn vị thể tắch, khi lượng tế bào vi khuẩn quá
thấp sẽ làm giảm tần số tiếp xúc với các mẫu thực vật do đó hiệu quả biến nạp khơng cao; ngược lại, khi lượng tế bào vi khuẩn quá cao ảnh hưởng tới sự phát triển của mẫu thực vật, thậm chắ làm chết mẫu trong q trình ni cấỵ Mục đắch của nghiên cứu này là xác ựịnh mật ựộ vi khuẩn (OD600) thắch hợp cho q trình biến nạp để sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium ựạt hiệu quả nhất.
Thắ nghiệm được tiến hành thử nghiệm với các mật ựộ OD600 0,2; 0,5; 0,8; của chủng vi khuẩn EHA 105, tổng số mẫu tương ứng với mỗi công thức là 350 mảnh lá mầm của giống cà chua DM166. Kết quả thắ nghiệm được trình bày ở Bảng 3.8.
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của mật ựộ vi khuẩn tới tần số biểu hiện tạm thời của gen Gus ở giống cà chua DM166. CT OD600 Số mẫu nhuộm Gus Số mẫu có ựốm xanh Tần số biểu hiện tạm thời (%) 1 0,0 0 0 0,00 2 0,2 350 16 4,57 3 0,5 350 60 17,14 4 0,8 350 58 16,57
Nhìn vào Bảng 3.7 chúng tơi thấy rằng: mật độ vi khuẩn (OD) ảnh hưởng rõ rệt ựến tần số chuyển gen. Khi theo dõi thắ nghiệm chúng tôi thấy, OD dịch khuẩn quá thấp dẫn ựến tần số biến nạp thấp do lượng khuẩn khơng đủ, cịn nếu OD quá cao sẽ gây chết mẫu mà trong khi tần số biến nạp không caọ
-Mẫu ựối chứng không ựược biến nạp với vi khuẩn cho kết quả biểu hiện tạm thời 0%.
-Ở OD = 0,2 tần số chuyển gen Gus vào mẫu thấp chỉ 4,57%
-Ở OD = 0,5 tần số chuyển gen Gus vào mẫu ựạt giá trị cao nhất 17,14% -Khi tăng nồng ựộ OD =0,8 tần số chuyển gen giảm chỉ ựạt 16,57%
Như vậy, từ kết quả thắ nghiệm trên cho ta kết luận: nồng độ OD thắch hợp khi biến nạp vi khuẩn là 0,5.
Kết quả chuyển gen của các tác giả trên thế giới có sự khác biệt rất lớn về mật ựộ vi khuẩn tối ưu, môi trường nuôi cấy cũng như biểu hiện của gen GUS. Theo Wu và cs. (2006), [55]sử dụng Agrobacterium tumefaciens LBA4404, plasmid pTOK233,
OD600nm = 0,15 trên cà chua Lichun cho biểu hiện GUS cao nhất 90,5%.
Theo Sun và cs. (2006)[49], Agrobacterium tumefaciens C58C1RifR mang plasmid pIG121Hm chuyển gen trên giống Micro-Tom cho biểu hiện gen GUS 40%.
Sharma v à c s. (2009) [48], ựã sử dụng Agrobacterium tumefaciens AGL1 mang plasmid pCTBE2L hoặc pRINASE2L chuyển gen trên giống Pusa Ruby, Arka Vikas, và Sioux cho thấy hơn 90% số lá có biểu hiện GUS.
Yasmeen (2009) [56], ựã sử dụng vi khuẩn mang vector pROKIIAP1GUSint hoặc pROKIILFYGUSint với các gen APETALA 1, LEAFY (LFY), GUS và NPTII
ựể chuyển gen trên cà chua Rio Grande cho tỷ lệ tái sinh là 30,4% và biểu hiện GUS ựạt 84%.
Theo Van T Dang và cs (2010)[54],, Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang pSoup và pGII0229, OD600nm = 0,5 cho tỷ lệ biểu hiện GUS cao nhất là 30,14% ở cà chua DM8.