1.7.6. Các phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tumefaciens
1.7.6.1 Hệ thống chuyển gen in vitro
Một số trợ giúp kỹ thuật trong q trình biến nạp đã cải thiện hiệu quả của hệ thống chuyển gen in vitro nhờ Ạtumefaciens bao gồm:
Xử lý sóng siêu âm
Xử lý một thực vật với Ạtumefaciens trong điều kiện sóng siêu âm tạo ra các tổn thương nhỏ, đồng nhất ở mơ thực vật, cho phép Ạtumefaciens dễ dàng xâm nhập vào tế bào thực vật. Bằng phương pháp này ựã cải thiện rõ rệt hiệu quả chuyển gen, biểu hiện Gus tạm thời ựã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các tế bào ựậu tương, ựậu ựũa, cây vân sam trắng, lúa mỳ và ngô [51].
Ly tâm tế bào
Phương pháp chuyển gen thông qua Ạtumefaciens kết hợp với ly tâm ựã ựược áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phơi hóa nhận được từ hoa chuối đực ni cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger. Tần số chuyển gen ựã ựược cải thiện ựáng kể bằng các áp dụng chế ựộ ly tâm tế bào
thực vật trong quá trình ni cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna H. và cs, 2004) [39].
Gây tổn thương
Các mô tế bào thực vật nhất là ựối với thực vật hai lá mầm khi bị tổn thương tạo ựiều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhiễm. Áp dụng cơ chế tự nhiên này, một số tác giả ựã tiến hành gây tổn thương cho các mô thực vật trước khi lây nhiêm với vi khuẩn và ựã thu ựược hiệu quả chuyển gen caọ đậu tương là một ựối tượng ựược ứng dụng nhiều cho phương pháp chuyển gen nàỵ Có nhiều tác giả đã cơng bố chuyển thành cơng các gen chỉ thị gus, gfp, hptẦ vào ựậu tương thông qua nốt lá mầm bị tổn thương [21,38].
1.7.6.2 Hệ thống chuyển gen in vivo
Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây (in planta) và rất phổ biến đối với lồi Ạthaliana, một trong những lồi cây mơ hình đối
với các nghiên cứu về di truyền học. Phương pháp chuyển gen này tốn ắt thời gian, bỏ qua cơng đoạn ni cấy mơ và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ được các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu ựược lớn hơn. Kỹ thuật này đã được mơ tả ở các cây trồng khác nhau như ựậu tương, Arabidopsis, hoa hướng dương, cây lạc, và cả ở cây ngô.
Phương pháp ngâm cụm hoa
Một số nghiên cứu chuyển gen ựã ựược tiến hành ở cây Arabidopsis bằng cách ngâm các thể giao tử cái của hoa non, cụm hoa trong dịch vi khuẩn Ạtumefaciens.
Phương pháp này cũng ựã ựược áp dụng với các cây một lá mầm. Chumakov và cộng sự (2006)[29] ựã chuyển ựược gen nptII vào dịng ngơ AT-3 bằng cách xử lý râu ngô của các cây ngơ đang sinh trưởng trên ựồng ruộng với dịch vi khuẩn Ạtumefaciens
chủng GV3101 (pTd33). Phân tắch PCR cho thấy khoảng 6,8% các cây con nảy mầm từ hạt nhận được từ các cây ngơ sau khi lây nhiễm bằng cách này mang gen nptIỊ
Phương pháp thấm lọc chân không
Phương pháp chuyển gen thấm lọc chân không cũng tương tự như phương pháp ngâm cụm hoạ Phương pháp này ựã ựược áp dụng ở một số cây trồng, ựặc biệt là cây một lá mầm. Trong môi trường chân không, tế bào thực vật tiếp xúc với Ạtumefaciens tốt hơn. Người ta nhận ựược các cây Megicago truncatula (cây mơ hình thuộc họ đậu) chuyển gen bền vững bằng phương pháp chuyển gen này (Trieu Ạ T. và cs, 2000)[52].