- Lấy mẫu chủ đích: n = 30 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu được xử lý theo phần mềm SPSS 16.0, với thuật toán 2
và T test.
2.3.4. Sơ đồ nghiên cứu.
2.4. Kỹ thuật và chỉ tiêu nghiên cứu.
2.4.1 Kỹ thuật nghiên cứu
2.4.1.1.Kỹ thuật lấy mẫu [Theo hướng dẫn của WHO 2010].
● Chuẩn bị lấy mẫu
- Bệnh nhân phải kiêng giao hợp từ 3-5 ngày.
- Tại thời điểm làm xét nghiệm tinh dịch đồ người chồng không sốt, không dùng thuốc, không uống rượu.
Mẫu tinh dịch (Lắc đều mẫu)
Cho cuvet vào lọ đựng mẫu, tinh dịch được hút vào mao dẫn
Cắm cuvet vào máy SQA-IIB Máy tự phân tích kết quả
Nhỏ 10 µl vào buồng đếm Makler Đếm độ di động
Cho một phần TD vào ống nghiệm,
để ống trong cốc nước 50-600 Nhỏ 10 µl vào buồng đếm Makler
Đếm mật độ
Nhỏ 10 µl TD vào lam kính, phủ lam
Đếm độ di động và xác định độ pha loãng theo hướng dẫn của WHO 2010
Nhỏ TD với độ pha loãng phù hợp theo WHO 2010 Tuýp I Tuýp II Cho DD pha loãng NaHCO3 5% + formalin 35% Buồng đếm Neubauer I Buồng đếm Neubauer II Đếm mật độ Đếm mật độ Tính độ khác biệt cho phép (WHO 2010) SQA-IIB Makler Neubauer Nhỏ 10 µl Nhỏ 10 µl
- Lấy mẫu tại phòng riêng gần phòng xét nghiệm để hạn chế sự thay đổi nhiệt độ đột ngột của tinh dịch và để theo dõi thời gian tinh dịch ly giải.
- Bệnh nhân cần nắm rõ thông tin về cách lấy mẫu như phải thu thập toàn bộ mẫu.
- Ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân trên bảng kết quả: Họ, tên, năm sinh, số ngay kiêng xuất tinh, thời gian lúc nhận mẫu và bắt đầu thực hiện xét nghiệm.
-Lọ đựng tinh dịch phải sạch, trên thành lọ đựng mẫu có ghi tên, tuổi bệnh nhân, ngày giờ lấy mẫu
● Cách lấy mẫu
- Bệnh nhân nên: Đi tiểu thật sạch trước khi lấy mẫu
- Tất cả lọ đựng mẫu, pipette, pipette tip, dùng để đựng và trộn mẫu đều phải sạch.
- Lọ đựng mẫu có miệng rộng để dễ thu thập tinh dịch, tránh rơi vãi ra ngoài, lọ được làm bằng loại nhựa đặc biệt không ảnh hưởng đến tinh trùng.
- Tinh dịch được lấy bằng tay như thủ dâm và xuất tinh trực tiếp vào lọ đựng mẫu.
- Đặt lọ đựng mẫu trong tủ ấm 370 C 30 phút để theo dõi ly giải.
- Tiến hành các bước thường quy để phân tích, xác định các thông số của mẫu: thể tích, sự ly giải, độ nhớt, pH, mật độ, độ di động, hình thái …theo tiêu chuẩn WHO (2010), đang được áp dụng thường quy tại Bộ môn Mô Phôi học- Trường Đại học Y Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.1.2. Kỹ thuật đánh giá tinh trùng di động và mật độ tinh trùng bằng buồng đếm Neubauer (theo hướng dẫn của WHO 2010).
Đánh giá độ di động bằng cách khảo sát sự di động tự nhiên của TT, sau đó tính tỉ lệ giữa tinh trùng di động trên tổng số TT trong cùng thể tích và được thể hiện bằng phần trăm.
Đánh giá di động khảo sát bằng mắt, sử dụng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Tiêu chuẩn đánh giá sự di động của TT theo 3 loại:
+ Di động tiến tới (PR): Tinh trùng di động tiến tới trước, tốc độ di chuyển không quan trọng.
+ Di động không tiến tới (NP): Tinh trùng di chuyển khó khăn, di động tại chỗ.
+ Không di động (IM) - Cách đánh giá phân loại di động:
+ Tạo tiêu bản ngay sau khi trộn mẫu thật đều, nhỏ 10 µl tinh dịch nên lam kính và đậy lam (22 x 22 mm), để tinh trùng ổn định trong 60 giây, khảo sát mẫu dưới vật kính 40x,
+ Đánh giá một cách hệ thống ít nhất 5 vi trường để xếp loại TT
+ Đánh giá trên một vùng giới hạn của vi trường nếu mật độ TT quá nhiều, đánh giá trên toàn bộ vi trường nếu mật độ ít
+ Đánh giá những tinh trùng còn nguyên vẹn đầu đuôi, đếm ít nhất 200 tinh trùng để giảm sai số và tránh chọn lựa vùng chỉ có đa số tinh trùng di động -Chọn các điểm đánh giá trên tiêu bản:
+ Theo hệ thống hình zic zac + Cách cạnh lam phủ vật 5cm -Chọn vị trí đánh giá trong vi trường
+ Trung tâm hoặc một góc vi trường + Toàn bộ vi trường nếu mật độ TT ít
- Dùng máy bách phân bạch cầu để phân loại tinh trùng. Trong vùng chọn giới hạn, cùng một thời gian các TT di động tiến tới (PR) được đếm trước, sau đó không tiến tới (NP) và bất động (IM). Không nên đợi TT bơi vào vùng đánh giá mới đếm.
- Trường hợp tổng số 200 tinh trùng đạt được trước khi tất cả các loại di động còn lại chưa được đếm từ vùng cùng đánh giá, nên đếm tiếp tục các loại di động còn lại cho dù hơn tổng số 200
- Tính trung bình cộng và tỉ lệ khác biệt giữ 2 lần đếm của PR, NP, IM.
- Chọn tỉ lệ trung bình cao nhất trong 3 giá trị (PR, NP, IM) để so với tỉ lệ khác biệt cho phép (bảng 2.1).
- Nếu khác biệt vượt quá số cho phép, tạo tiêu bản khác đánh giá lại - Nếu khác biệt chấp nhận được, kết quả là tỉ lệ trung bình PR, NP, IM.
Bảng 2.1. Tỉ lệ khác biệt cho phép giữa tỉ lệ trung bình và khác biệt giữa 2 lần đếm (mỗi lần đếm 200) Tỉ lệ trung bình (%) Tỉ lệ khác biệt cho phép Tỉ lệ trung bình (%) Tỉ lệ khác biệt cho phép 0 1 66-76 9 1 2 77-83 8 2 3 84-88 7 3-4 4 89-92 6 5-7 5 93-95 5 8-11 6 96-97 4 12-16 7 98 3 17-23 8 99 2 24-34 9 100 1 35-65 10 b. Đánh giá mật độ tinh trùng .
- Xác định độ pha loãng tinh dịch cho phù hợp dựa theo số lượng tinh trùng trên vi trường 40x, thường chọn độ pha loãng lúc đánh giá di động.
- Dung dịch pha loãng NaHCO3 5% : Hoà tan 50g NaHCO3 trong 1000 ml nước cất, thêm vào 10ml formalin 35%.
- Cách xác định độ pha loãng, cách pha loãng và chọn vùng đánh giá mật độ tinh trùng dựa theo bảng 2.2.
- Dựa vào độ pha loãng và số tinh trùng đếm được, các vùng khác nhau của buồng đếm được sử dụng để tính mật độ .
+ Đối với độ pha loãng 1/20 (1+19) và 1/5 (1+4), đếm tinh trùng trong những hàng của lưới ô vuông số 5 trước, tiếp tục ở lưới ô vuông số 4 và 6 khi cần thiết.
+ Đối với độ pha loãng 1/2 (1+1), đếm TT trong tất cả 9 lưới ô vuông khi cần để đếm đủ 200 tinh trùng.
Bảng 2.2. Quy định độ pha loãng, cách pha, vùng đếm tinh trùng (theo WHO 2010). Tinh trùng/ vi trƣờng 40x Tinh trùng/ vi trƣờng 20x Độ pha loãng quy định Thể tích tinh dịch (μl) Thể tích dung dịch pha loãng (μl) Vùng đánh giá lƣới ô vuông > 101 > 404 1:20 (1+19) 50 950 5,4,6 16-100 64-400 1:5 (1+4) 50 200 5,4,6 2-15 8-60 1:2 (1+1) 50 50 5,4,6 < 2 < 8 1:2 (1+1) 50 50 Tất cả 1 9 ■ Chuẩn bị buồng đếm:
Dán lam phủ lên buồng đếm bằng cách dùng nước bôi ướt 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lam phủ lên hoặc hà hơi thổi lên 2 gờ của buồng đếm rồi đặt lam phủ lên. Lam phủ phải được dán sát để đảm bảo độ sâu của buồng đếm 100μm.
■Chuẩn bị pha loãng:
+ Dùng pipette tự động chỉnh thể tích thích hợp hút dung dịch pha loãng NaHCO3 5% vào 2 ống nghiệm, độ pha loãng như nhau.
+ Trộn đều mẫu thử.
+Hút tinh dịch với thể tích thích hợp ngay sau khi trộn đều. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Lau sạch tinh dịch bên ngoài của pipette-tip, cẩn thận không chạm vào nút tháo bỏ pipette-tip.
+ Phân phối tinh dịch vào 2 ống nghiệm chứa dung dịch pha loãng. + Trộn đều bằng cách hút rửa pipette-tip.
+ Trộn đều mẫu pha loãng thứ 1 trong 10 giây. ■ Đặt mẫu vào buồng đếm:
+ Lấy ngay 10μl huyền dịch được trộn, tránh để tinh trùng lắng xuống. + Đặt pipette-tip chạm vào cạnh dưới của lam phủ buồng đếm.
+ Đẩy từ từ huyền dịch ra, làm đầy buồng đếm thứ nhất bởi lực mao dẫn, không quá ít hay đầy tràn, lam phủ không được di chuyển khi đặt mẫu.
+ Để yên 1 phút cho tinh trùng ổn định
+ Đánh giá mẫu trong vòng 10 – 15 phút (nếu để lâu mẫu sẽ bay hơi
+ Xử lý tương tự đối với mẫu pha loãng thứ 2 và làm đầy buồng đếm thứ 2.
■ Cách đếm tinh trùng trong lưới ô vuông:
+ Đếm tinh trùng dựa vào vị trí của đầu tinh trùng không dựa vào vị trí của đuôi. Ranh giới của ô vuông lớn là đường giữa của 3 đường viền song song.
+ Đếm tất cả tinh trùng nằm trong ô vuông lớn, đếm TT có đầu nằm giữa 2 đường viền bên trong, không đếm tinh trùng có đầu nằm giữa 2 đường viền bên ngoài.
+ Để tránh đếm lặp lại TT trong các ô vuông liền kề, tinh trùng nằm trên đường phân chia giữa 2 ô vuông chỉ được đếm 1 lần. Đếm TT có đầu nằm trên đường phân chia phía dưới và bên trái của ô vuông.
+ Cần ghi nhận nếu có nhiều TT đầu kim hoặc TT không đuôi trong mẫu. Khi cần thiết có thể đánh giá mật độ của chúng giống như TT bình thường hoặc đánh giá qua phương pháp nhuộm.
■ Đánh giá số lượng tinh trùng trên buồng đếm: + Khảo sát đánh giá với vật kính 40x.
+ Đếm ít nhất 200 tinh trùng trên mỗi buồng của buồng đếm.
+ Đánh giá lưới ô vuông số 5 trước, bắt đầu từ cạnh của lưới ô vuông. đếm tinh trùng theo từng hàng.
+ Đếm ít nhất 200 tinh trùng, tiếp tục đếm đến hết hàng cho dù hơn tổng số 200.
+ Nếu đếm chưa đủ 200 tinh trùng trong 5 hàng của lưới ô vuông số 5, đếm tiếp tục những hàng trong lưới ô vuông số 4 và 6.
+ Nếu số tinh trùng đếm ở các ô số 4,5 và 6 chưa đủ 200, không tiếp tục đếm ở các ô số 1, 2, 3, 7, 8 và 9 do thể tích mỗi hàng trong các ô vuông này khác với thể tích mỗi hàng trong ô số 4, 5, và 6. Nên chọn độ pha loãng thấp hơn, có thể pha loãng 1/2 (1+1).
+ Ghi nhận số hàng đánh giá đạt ít nhất 200 tinh trùng. Số hàng tương tự sẽ được đếm ở buồng thứ 2 của buồng đếm Neubauer.
+ Đếm số tinh trùng và số hàng bằng máy bách phân bạch cầu.
+ Chuyển buồng thứ 2 của buồng đếm và thực hiện các bước giống buồng thứ 1.
+ Đếm tinh trùng trong những hàng tương tự với số hàng đã đếm ở buồng thứ 1 ngay khi đếm ít hơn 200 tinh trùng.
+ Tính tổng và hiệu của hai số đếm.
+ So sánh kết quả cho phép theo bảng 2.3. Nếu khác biệt chấp nhận được Tính mật độ.
Nếu khác biệt vượt quá số cho phép Pha loãng và đánh giá lại.
Không nên đánh giá 2 lần trên cùng 1 buồng của Neubauer hoặc đánh giá 2 buồng với cùng 1 mẫu pha loãng, điều này có thể dẫn đến sai số khi lấy mẫu, sai số do pha loãng hoặc do trộn không đều.
■ Công thức tính mật độ
C = (N/n) × ( hệ số pha loãng) TT/nl (106/ml tinh dịch) C: Mật độ tinh trùng
N : Tổng số tinh trùng đếm được trong 2 buồng đếm n : Tổng số hàng khảo sát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.3. Khác biệt cho phép giữa tổng số và hiệu số đếm trên 2 tiêu bản tính mật độ tinh (theo hướng dẫn của WHO 2010).
Tổng cộng Sai biệt chấp nhận Tổng cộng Sai biệt chấp nhận
144 – 156 24 329 – 346 36 157 – 169 25 347 – 366 37 170 – 182 26 367 – 385 38 183 – 196 27 386 – 406 39 197 – 211 28 407 – 426 40 212 – 226 29 427 – 448 41 227 – 242 30 449 – 470 42 243 - 258 31 471 – 492 43 259 – 274 32 493 – 515 44 275 – 292 33 516 – 538 45 293 – 309 34 539 – 562 46 310 – 328 35 563 – 587 47
Thể tích 1 hàng trong lưới ô vuông số 4, 5 và 6 là 20nl→1nl = 1/20 + Với độ pha loãng 1/5 (1+ 4), sử dụng lưới ô vuông số 4, 5, và 6
C = (N/n) × (1/20)× 5 TT/nl = (N/n) × (1/4) TT/nl (106/ml tinh dịch) + Với độ pha loãng 1/20 (1+19), sử dụng lưới ô vuông số 4, 5 và 6
C = (N/n) × (1/20) × 20 TT/nl = (N/n) TT/nl (106/ml tinh dịch) + Với độ pha loãng 1/50 (1+49), sử dụng lưới ô vuông 4, 5 và 6
C = (N/n) × (1/20) × 50 TT/nl = (N/n) × 2,5 TT/nl (106/ml tinh dịch) Giới hạn tối thiểu của mật độ TT trong mẫu là 15.106
2.4.1.3. Kỹ thuật đánh giá tinh trùng di động và mật độ tinh trùng bằng buồng đếm Makler [54].
- Nhỏ 10μl tinh dịch (không cần pha loãng) đặt vào trung tâm buồng đếm Makler (trung tâm của vòng tròn), đặt nắp kính bao phủ lên trên, làm sao tinh dịch phải được đồng nhất (không có bong bóng, không khí trong buồng) và không được trào đến cọc thạch anh.
- Khảo sát bằng vật kính 20X. ■ Chuẩn bị buồng đếm:
Trước khi sử dụng, phải chắc chắn mặt phẳng tương phản lớp kính hoàn toàn sạch sẽ và không bị bụi.
■ Phân tích tinh dịch:
Trộn đều mẫu, cẩn thận để tránh hình thành bọt, bong bóng. Với việc, dùng pipet hút một giọt 10 μl tinh dịch rồi nhỏ vào trung tâm đĩa của buồng đếm, nhanh chóng đậy nắp buồng đếm, ấn nhẹ để tinh dịch đồng nhất. Nâng buồng đếm bằng tay cầm và đặt nó trên khoang của kính hiển vi.
Sử dụng vật kính 20X để đếm tinh trùng
Sau khi điều chỉnh tiêu cự, di chuyển từng đoạn của kính hiển vi và xác định đúng vị trí lưới trong trung tâm của phạm vi tầm nhìn.
+ Đánh giá tinh trùng di động:
- Sau khi cho mẫu vào buồng đếm tiến hành đánh giá di động của tinh trùng trong khoảng 3-5 phút, để tránh đếm sai khi các TT từ ngoại vi xâm nhập vào.
- Đếm theo hàng ngang theo hệ thống zic zac. - Đếm khoảng 200 tinh trùng, tính trung bình.
- Dùng máy bách phân bạch cầu để phân loại tinh trùng. Trong vùng chọn giới hạn, cùng một thời gian đếm tinh trùng di động tiến tới (PR), tinh trùng di động không tiến tới (NP) và TT không di động (IM).
+ Đánh giá mật độ tinh trùng:
Bất động TT bằng cách: một phần mẫu ban đầu được chuyển vào ống nghiệm khác để làm bất động TT, sau đó ống nghiệm được đặt vào trong nước từ 50-60 độ (thường 2/3 nước sôi và 1/3 nước máy). Sau đó lấy một giọt tinh dịch đã được sử lý bất động này nhỏ vào buồng đếm và tính kết quả.
Cách đánh giá: Số TT có trong diện tích 10 ô vuông, số TT sau đó được nhân với 1.000.000 tinh trùng/ ml. Trong trường hợp mẫu có ít TT thì sẽ đếm toàn bộ 100 ô vuông, lúc đó số lượng TT sẽ được nhân với 100.000 tinh trùng/ ml.
2.4.1.4 .Kỹ thuật đánh giá tinh trùng di động và mật độ tinh trùng bằng máy phân tích tự động SQA-IIB [56].
- Sau khi lắc đều mẫu, nhúng một đầu cuvet có ống mao dẫn vào lọ đựng mẫu, tinh dịch sẽ được hút từ từ vào trong mao dẫn (khoảng 10 µl), dùng tăm bông lau sạch bên ngoài cuvet, sau đó cắm nhẹ nhàng cuvet vào buồng phân tích, máy sẽ tự động đọc các kết quả trong vòng 1 phút.
2.4.2. Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Đánh giá được mật độ tinh trùng ở 3 nhóm mẫu của 3 phương pháp - Đánh giá được tỉ lệ TT di động tiến tới và không tiến tới (PR, PR + NP) và TT không di động (IM) ở 3 nhóm mẫu của 3 phương pháp. - So sánh chỉ số thu được giữa các phương pháp:
+ Buồng đếm Neubauer với buồng đếm Makler
- Tìm ra được những ưu nhược điểm của từng phương pháp: + Thời gian phân tích mẫu tinh dịch
+ Tính khách quan và chủ quan trong xét nghiệm + Các bước kỹ thuật trong quá trình phân tích mẫu
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});