CHUẨN HÓA CÁC XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG CÁC TỰ KHÁNG

Một phần của tài liệu NGHIÊN CỨU KHÁNG THỂ KHÁNG GAD Ở BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG KHÔNG THỪA CÂN, BÉO PHÌ (Trang 38 - 116)

KHÁNG THỂ TỰ MIỄN TRONG ĐÁI THÁO ĐƯỜNG

Kháng thể kháng GAD và IA-2A thường được đo bằng sử dụng xét nghiệm gắn kết phóng xạ. Xét nghiệm này cho thấy có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong hầu hết các phòng xét nghiệm tham gia Chương Trình Chuẩn Hóa Tự Kháng Thể trong bệnh đái tháo đường. Xét nghiệm ELISA trước đây được xem là không tốt. Tuy nhiên trong các hội thảo gần đây vài phòng xét nghiệm đã đưa ra các bộ kit ELISA cho kháng thể kháng GAD và IA-2A có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với xét nghiệm gắn kết phóng xạ.

Lý giải kết quả định lượng các tự kháng thể tự miễn cũng quan trọng và dễ sai lầm. Do các trị số là các biến số liên tục và có sự trùng lấp giữa người bệnh và người bình thường nên xác định tự kháng thể là âm tính hay dương tính không đơn giản. Giá trị cut-offs được chọn sao cho thuận lợi nhưng không thể tùy tiện. Nếu chọn ngưỡng cao thì ít có nguy cơ xếp nhầm người khỏe thành người bệnh, nếu chọn ngưỡng thấp thì ít nguy cơ xếp nhầm người bệnh thành người khỏe. Giá trị cut-offs được chọn dựa trên phần trăm trong dân số chứng, thường là 99%.

Các kháng thể tự miễn có lợi ích lớn trong chẩn đoán và tiên lượng. Giá trị của các xét nghiệm được thể hiện qua các chỉ số là độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm. Thế nhưng trong việc định lượng các kháng thể tự miễn thì mỗi phòng xét nghiệm lại có các giá trị khác nhau, độ nhạy, độ đặc hiệu của cùng một xét nghiệm nhưng được thực hiện tại các phòng xét nghiệm khác nhau lại cho ra các giá trị khác nhau. Do vậy đã có nhiều hội thảo quốc tế đề xuất ra các tiêu chuẩn nhằm chuẩn hóa như là hội thảo của hiệp hội đái tháo đường và miễn dịch, các chương trình chuẩn hóa tự kháng thể trong bệnh đái tháo đường… nhằm phát triển ngưỡng cho độ nhạy và độ đặc hiệu, chuẩn hóa các thuốc thử, các thuốc chứng và đơn vị thống nhất cho các xét nghiệm.

Biểu đồ 1.5. Các tự kháng thể xuất hiện vào lúc chẩn đoán ĐTĐ típ 1 [84]

Bảng 1.4. Tỷ lệ dương tính của các kháng thể tự miễn ở bệnh nhân đái tháo đường típ 1[61] Kháng thể Tỷ lệ % Trẻ em Người lớn Kháng thể kháng GAD Kháng thể kháng IA2 IAA ICA Kháng thể kháng GAD hoặc kháng thể kháng IA2 hoặc IAA

70-80 60-70 50-70 80-90 95-10 70-80 30-50 20-30 70-80 70-80

1.10. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ KHÁNG THỂ KHÁNG GAD TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC

Theo nghiên cứu UKPDS 25, tỷ lệ tìm thấy ICA dương tính là 5,8%, kháng thể kháng GAD dương tính là 9,8% trong số 3.672 bệnh nhân được chẩn đoán ĐTĐ típ 2 [69].

Nghiên cứu ở Thụy Điển kháng thể kháng GAD dương tính 8% ở bệnh nhân ĐTĐ mới được chẩn đoán và 3,2% ở bệnh nhân ĐTĐ típ 2. Nghiên cứu ở Hà Lan kháng thể kháng GAD dương tính khoảng 3%. Nghiên cứu ở Trung Quốc 16% bệnh nhân ĐTĐ típ 2 có kháng thể kháng GAD dương tính. Nghiên cứu ở Nhật trong 289 bệnh nhân ĐTĐ không cần insulin tại thời điểm chẩn đoán có 47% kháng thể kháng GAD dương tính.

Ở Việt nam có hai đề tài nghiên cứu về tỷ lệ kháng thể kháng GAD ở những bệnh nhân được chẩn đoán đái tháo đường típ 2 của Tiến sĩ Don là 11,93% và của Tiến sĩ Khánh là 13,9%.

Hiện nay, tại Việt nam chưa có tài liệu nào nghiên cứu về tỷ lệ và nồng độ kháng thể kháng GAD trong quần thể đái tháo đường không thừa cân, béo phì và tuổi ≥ 35.

Bảng 1.5. Các nghiên cứu về kháng thể kháng GAD dương tính ở bệnh nhân

đái tháo đường ở Châu Âu[51]

Số

lượng Nước

Loại

thiết kế Tuổi Mẫu

Tiêu chuẩn khác Tần suất 34 Ý Quần thể 30-50 ĐTĐ mới (130) BMI< 23 22,3% 24 Ý Quần thể > 40 2076 test OGTT bình thường hay giảm 2,8% giảm OGTT, 1% OGTT bình thường 23 Phần Lan Quần thể 28-83 Tất cả là NIR (1122) FBG≥ 6,1 OGTT sau 2 giờ≥10 9,3% ds chung, 19,3% ≥ 45 tuổi, 8,2% > 45 tuổi 32 Thụy Điển Lâm sàng rõ rệt 40-75 ĐTĐ mới (203) 8% ds chung, 3,2% trong NIR 35 U.K Quần thể đại diện 25-65 NIR mới (3672) Da trắng 10% ds chung, 34% tuổi 25-34, 7% tuổi 55-65 33 Hà Lan Quần thể 50-74 Quần thể chung, những BN biết ĐTĐ và tầm soát ĐTĐ (2350) Anti- GAD(+) nếu >99% trong toàn bộ quần thể 3,5%(0,7- 10%) ở bn biết ĐTĐ, 0%(0- 3,3%)ở bn tầm soát ĐTĐ 15 Phần Lan Bs đa khoa giới thiệu từ quần thể xác định 45-64 NIR mới (133) Xác định bằng OGTT 9%

Viết tắt: NIR (non–insulin-requiring diabetes): đái tháo đường không phụ thuộc insulin. OGTT (oral glucose tolerance test): xét nghiệm dung nạp glucose uống. FBG (fasting blood glucose): glucose máu lúc đói. DS: Dân số. Bn: Bệnh nhân.

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Những bệnh nhân đái tháo đường tuổi ≥ 35, không thừa cân, béo phì ( BMI < 23 vào thời điểm đến khám bệnh) tự đến khám hay do các cơ sở y tế khác chuyển đến tại phòng khám và tại khoa nội trú Bệnh viện Hoàn Mỹ Sài Gòn từ tháng 03/2009 đến tháng 07/2010.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đây là phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang, với cách lấy mẫu thuận lợi và liên tục nên có cỡ mẫu trong nghiên cứu của chúng tôi là N = 156 bệnh nhân.

2.2.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh

Bệnh nhân đủ các điều kiện sau:

- Đái tháo đường được chẩn đoán theo tiêu chuẩn ADA (2010). - BMI < 23 (thể trọng không thừa cân, béo phì).

- Tuổi phát hiện bệnh đái tháo đường ≥ 35 tuổi.

2.2.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Không đưa vào nghiên cứu những bệnh nhân ĐTĐ có kèm theo: - Tuổi phát hiện bệnh đái tháo đường < 35 tuổi.

- BMI ≥ 23.

- Tiền sử gia đình có người bị ĐTĐ típ 1: cha, mẹ, anh, chị, em ruột. - Có tiền sử bị ĐTĐ thai kỳ.

2.2.3. Nhóm chứng: cỡ mẫu 30 trường hợp, chọn những bệnh nhân - Không có bệnh đái tháo đường.

- BMI < 23. - Tuổi ≥ 35.

2.3. CÁC BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU2.3.1. Tuổi: tại thời điểm nghiên cứu 2.3.1. Tuổi: tại thời điểm nghiên cứu

2.3.2. Tuổi phát hiện bệnh đái tháo đường: là tuổi tại thời điểm được chẩn đoán bệnh đái tháo đường lần đầu tiên.

2.3.3. Thời gian phát hiện bệnh: Được tính từ khi được chẩn đoán bệnh đái tháo đường cho đến thời điểm nghiên cứu.

2.3.4. Giới tính

2.3.5. Tiền sử gia đình và bản thân

- Về bệnh đái tháo: ghi nhận cha, mẹ hay anh, chị em ruột có đang điều trị bệnh đái tháo đường típ 2 hay không.

- Về bệnh lý tự miễn khác:

2.3.6. BMI

Dựa vào bảng phân loại thể lực theo chỉ số cơ thể (BMI) của WHO 2000, áp dụng cho Châu Á [75].

BMI = Cân năng (kg) (Chiều cao)2 (m2)

Đo trọng lượng cơ thể: dùng cân bàn Trung Quốc có gắn thước đo chiều cao, độ chính xác đến 0,1 kg.

Bệnh nhân được cân với trang thái không mang giầy, mặc quần áo nhẹ không dầy

Đo chiều cao cơ thể (bằng thước đo gắn với cân): tư thế đứng thẳng, hai gót chân chụm lại hình chữ V, đi chân trần, đảm bảo bốn điểm trên cơ thể: chẩm, xương vai, mông, gót chân chạm mạnh vào thước đo, độ chính xác đến 1mm.

Bảng 2.1.Phân loại BMI [75] Xếp loại BMI Gầy < 18,5 Bình thường 18,5- 22,9 Thừa cân 23- 24,9 Béo phì độ 1 25-29,9 Béo phì độ 2 ≥ 30 2.3.7. Vòng bụng

Chẩn đoán béo phì dạng nam theo tiêu chuẩn WHO 2000 [75]

Dùng thước dây Trung Quốc sản xuất không đàn hồi có độ chính xác đến 1mm.

Đo vòng bụng: bệnh nhân đứng thẳng, hai chân dang rộng khoảng 10 cm, bộc lộ vùng đo, vòng bụng được đo vào lúc thở ra nhẹ nhàng, đo ngang qua rốn và điểm giữa mào chậu với xương sườn 12.

Kết quả: một người được chẩn đoán béo phì vùng bụng khi số đo vòng bụng của nam ≥ 90 cm và nữ ≥ 80 cm theo tiêu chuẩn WHO 2000 [75].

2.3.8. Huyết áp động mạch

Đo bằng máy đo huyết áp đồng hồ hiệu microlife của hãng Thụy Sĩ, đã được điều chỉnh với máy thủy ngân.

Bệnh nhân không được hút thuốc lá, không uống rượu, không uống cà phê trước khi đo 30 phút.

Phương pháp đo [4]

- Để bệnh nhân ngồi 5 phút trong một phòng yên tỉnh trước khi bắt đầu đo huyết áp.

- Tư thế ngồi đo HA là thường quy.

- Cởi bỏ quần áo chật, cánh tay để tựa trên bàn ở ngang mức tim, thả lỏng tay và không nói chuyện trong khi đo.

- Đo ít nhất hai lần cách nhau 1-2 phút, nếu hai lần đo này quá khác biệt thì tiếp tục đo thêm vài lần nữa.

- Băng quấn đặt ngang mức tim dù bệnh nhân ở tư thế nào. Mép dưới băng quấn trên nếp lằn khuỷu 3 cm.

- Sau khi áp lực hơi trong băng quấn làm mất mạch quay, bơm hơi lên tiếp 30 mmHg nữa.

- Sử dụng âm thanh pha I và pha V của Korotkoff để xác định HATT. - Chọn huyết áp tâm thu là thời điểm xuất hiện tiếng đập thứ nhất. - Chọn huyết áp tam trương là thời điểm tiếng đập biến mất (pha V). - Đo cả 2 tay, lấy trị số HA bên tay lớn hơn

Chẩn đoán tăng huyết áp: Dựa vào tiêu chuẩn của WHO/ISH 2003. Bảng phân loại tăng huyết áp WHO/ISH 2003 [4], Hội Tăng huyết áp Việt Nam 2007 cũng chọn theo cách phân độ này

Bảng 2.2. Phân loại tăng huyết áp [4]

Phân loại HATT (mmHg) HATTr (mmHg)

HA tối ưu < 120 < 80 HA bình thường < 130 < 85 HA bình thường nhẹ 130-139 85-89 THA độ 1 (nhẹ) 140-159 90-99 THA độ 2 (trung bình) 160-179 100-109 THA độ 3 (nặng) ≥ 180 ≥ 110

THA tâm thu đơn độc ≥140 < 90

Bệnh nhân được chẩn đoán tăng huyết áp khi bệnh nhân sử dụng thuốc tăng huyết áp hoặc huyết áp ≥ 130/80 mmHg ít nhất 2 lần kiểm tra [4].

2.3.9. Cận lâm sàng

2.3.9.1. Glucose huyết tương lúc đói

- Nguyên tắc:

Định lượng glucose đặc hiệu theo phương pháp enzyme màu. Phương pháp định lượng glucose huyết tương này thực hiện dựa trên phản ứng xúc tác của gluco-oxydase: oxy hoá glucose thành acid gluconic và peoxide hydrogen.

Peoxide hydrogen tác dụng với 4- aminoantipyrine và phenol dưới xúc tác của peroxydase tạo thành chất có màu hồng là quinoleimine và nước. Đo mật độ quang của đỏ quinoleimine ở bước sóng 500 nm sẽ tính được kết quả glucose huyết tương.

- Phương pháp tiến hành:

Lấy 1ml máu tĩnh mạch lúc đói (sau 8 giờ nhịn đói) để định lượng glucose huyết tương theo phương pháp glucose oxydase với thuốc thử của Roche trên máy Cobas 6000 của Đức.

- Dựa vào tiêu chuẩn chẩn đoán của ADA năm 2010

Chẩn đoán là đái tháo đường khi bệnh nhân có một trong ba tiêu chuẩn sau: - Có triệu chứng lâm sàng của tăng glucose máu bao gồm: tiểu nhiều, uống nhiều, khát nước, sụt cân không giải thích được, cộng với nồng độ glucose huyết tương bất kỳ trong ngày ≥ 200 mg/dl (≥ 11,1 mmol/l)

- Hoặc glucose huyết tương lúc đói (sau 8 giờ nhịn đói) ≥ 126mg/dl (≥ 7mmol/l)

- Hoặc glucose huyết tương 2 giờ sau uống 75g glucose ≥ 200mg/dl (≥ 11,1mmol)

Chẩn đoán chỉ được xác định với xét nghiệm lần thứ hai (ngày sau) có kết quả thỏa mãn các tiêu chuẩn trên.

Nếu bệnh nhân có giảm dung nạp glucose huyết tương thì tiến hành làm nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống. Khi tiến hành nghiệm pháp bệnh nhân phải thỏa các điều kiên sau:

+ Bệnh nhân có chế độ hoạt động thể lực và ăn uống bình thường (hơn 150g glucose/ ngày) ba ngày trước khi làm nghiệm pháp.

+ Không có bệnh lý cấp tính kèm theo.

+ Không có dùng các thuốc nhóm glucocorticoid, lợi tiểu thiazide, thuốc ức chế beta giao cảm, ức chế calci, estrogen, phenytoin ít nhất ba ngày trước đó.

+ Nhịn đói qua đêm

+Trước khi tiến hành nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống, bệnh nhân phải nghỉ ngơi ít nhất 30 phút.

+ Trong thời gian thử test bệnh nhân có thể ngồi nhưng không được hút thuốc lá.

Chống chỉ định làm test nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống:

+ Nếu chẩn đoán đái tháo đường được xác định bởi tăng rõ ràng glucose huyết tương và các triệu chứng kinh điển của tăng glucose máu, hoặc hai lần glucose huyết tương lúc đói ≥ 126mg/dl (≥ 7mmol/l). Thực hiện nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống có thể có hại vì gây tăng glucose máu.Hơn nữa nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống không cung cấp thêm thông tin gì có giá trị.

+ Những bệnh nhân đang có stress cấp tính về bệnh lý nội hoặc ngoại khoa vì có thể dẫn đến kết quả nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống dương tính giả. Nghiệm pháp dung nạp glucose bằng đường uống nên trì hoãn vài tháng sau khỏi bệnh.

+ Những người suy dinh dưỡng mạn tính.

+ Những người nằm liệt gường từ 3 ngày trở lên.

- Cách tiến hành

+ Lấy máu định lượng glucose huyết tương lúc đói.

+ Cho bệnh nhân uống 75 gam glucose pha trong 250 ml nước sôi để nguội uống trong 5 phút.

+ Hai giờ sau khi uống lấy máu định lượng glucose huyết tương.

- Kết quả:

Đái tháo đường khi glucose huyết tương sau 2 giờ ≥ 200 mg/dl (11,1 mmol/l).

2.3.9.2. HbA1c

Đinh lượng HbA1c trong máu theo phương pháp ức chế miễn dịch đo độ đục và xử dụng thuốc thử là HbA1c II hoặc Hemolyzing Reagent của hãng ROCHE trên máy Cobas 6000.

Tiêu chuẩn HbA1c ≥ 6,5g% được ADA 2010 đưa thêm vào trong tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ [11]

Mục tiêu của HbA1c trong điều trị bệnh nhân đái tháo đường là < 7g%. Kiểm soát glucose máu kém khi HbA1c ≥ 8g%.

HbA1c bình thường của người Việt Nam khoảng 5-6%.

Kết quả HbA1c bị ảnh hưởng nếu bệnh nhân đái tháo đường có bệnh lý thiếu máu, bệnh hemoglobin đi kèm

2.3.9.3. Bilan Lipid

Chẩn đoán rối loạn lipid máu theo tiêu chuẩn NCEP dành cho người trưởng thành theo ATP- III gồm tăng cholesterol toàn phần, tăng LDL-c, tăng Triglycerid và giảm HDL-c.

Chúng tôi định lượng Triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL-c và HDL- c huyết tương theo phương pháp so màu enzyme mactic clory metric, sử dụng thuốc thử của hãng ROCHE trên máy Cobas 6000.

Bảng 2.3. Bảng phân loại rối loạn chuyển hóa lipid máu theo NCEP dành cho người lớn về rối loạn lipid máu qui ước số III (2001) [47]

Thành phần Nồng độ mg/dl (mmol/l) Đánh giá nguy Total cholesterol < 200 (5,17) 200- 239 (5,17-6,18) ≥ 240 (6,1) tốt cao giới hạn cao HDL-c < 40 (1,03) > 60 (1,55) thấp cao LDL-c < 100 (2,58) 100-129 (2,58- 3,33) 130-159 (3,36-4,11) 160-189 (4,13- 4,88) ≥ 190 (4,91) Tối ưu Gần tối ưu Cao giới hạn Cao Rất cao Triglycerid < 150 (1,6) 150-199 (1,69- 2,25) 200- 499 (2,22- 5,64) ≥ 500 (5,65) Bình thường Cao giới hạn Cao Rất cao

2.3.9.4. Định lượng nồng độ kháng thể kháng Glutamic acid decarboxylase trong huyết tương

Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA (miễn dịch huỳnh quang), với thuốc thử là Isletest-GAD của hãng BIOMERICA trên máy Evolis của hãng Bio-Rad để phát hiện kháng thể kháng Glutamic acid decarboxylase ở bệnh nhân đái tháo đường không thừa cân, béo phì.

-Nguyên tắc: dùng kháng nguyên Glutamic acid decarboxylase tinh chế được cố định trong giếng nhỏ. Kháng thể kháng Glutamic acid decarboxylase đặc biệt IgG có trong huyết thanh của bệnh nhân sẽ phản ứng với kháng nguyên. Một lượng lớn protein trong huyết thanh không được kếp hợp sẽ được rửa ra khỏi giếng.

Một kháng thể được gắn với enzyme (alkaline phosphatase), đặc biệt với IgG người sẽ được cho vào phức hợp kháng nguyên kháng thể Glutamic acid decarboxylase.

Sau đó rửa loại bỏ các enzyme không kếp hợp ra khỏi giếng, một chất nền PNPP được cho thêm vào và màu sắc được tạo ra sẽ được đo với máy quang phổ. Cường độ màu phản ánh trực tiếp nồng độ kháng thể kháng Glutamic acid decarboxylase trong test này.

-Phương pháp tiến hành:

Lấy 2 ml máu tĩnh mạch cho vào ống nghiệm có hột (màu đỏ), sau đó sử

Một phần của tài liệu NGHIÊN CỨU KHÁNG THỂ KHÁNG GAD Ở BỆNH NHÂN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG KHÔNG THỪA CÂN, BÉO PHÌ (Trang 38 - 116)

Tải bản đầy đủ (DOC)

(116 trang)
w