2.2.1. Phân lập nấm vùng rễ.
2.2.1.1. Phương pháp thu thập mẫu:
Gạt bỏ 3cm đất bề mặt để loại trừ thảm mục thực vật. Dùng xẻng đã đƣợc vô trùng bằng cồn đào lấy phần bầu đất quanh rễ cây (ở độ sâu 0 – 20cm). Đào lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non. Mẫu đất sau khi đƣợc thu thập về để khô tự nhiên tránh môi trƣờng ô nhiễm và riêng biệt, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2 -5o
C) trƣớc khi sử dụng cho phân lập hoặc đồng nuôi cấy.
2.2.1.2. Phương pháp phân lập bào tử AM.
Phân lập bào tử AM trong mẫu đất thu thập ở hiện trƣờng phân lập theo phƣơng pháp lọc ƣớt của Gerdeman and Nicolson, 1963.
Lấy 100 gam đất ngâm với 2 lít nƣớc, khuấy nhẹ tạo thành dung dịch huyền phù.
Đổ từ từ dung dịch qua các rây có kích thƣớc lần lƣợt là 1000, 250, 100, 45µm.
Bỏ phần cặn trên rây 1000µm vì ở rây này thƣờng không có bào tử mà chủ yếu là các mảnh rác hữu cơ. Lấy phần cặn trên rây 250 µm, 100 và 45 µm rửa sạch ly tâm lần 1 ở 5000 vòng/ 5 phút với nƣớc. Bỏ dịch trong trong các ống ly tâm lấy phần cặn hòa tan trong dung dịch đƣờng sucrose 480g/l và ly tâm lần 2 với tốc độ 2500 vòng/ phút trong 5 phút. Sau ly tâm, đổ dịch nổi qua rây 45 µm và rửa sạch bằng nƣớc cất rồi cho vào đĩa Petri để quan sát. Sau đó từ các đĩa Petri này, tiến hành phân lập và đếm bào tử.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
2.2.1.3. Phương pháp phân lập các chủng nấm vùng rễ (EM).
Theo phƣơng pháp của Harvey, Linda M. 1991. Rửa mẫu dƣới vòi nƣớc chảy trong 5 phút. Khi bề mặt mẫu đã ráo nƣớc, ngâm mẫu trong cồn 70o trong 1 phút. Để mẫu khô trong tủ cấy vô trùng. Dùng dụng cụ vô trùng cắt mẫu rễ thành những đoạn nhỏ dài từ 5-10mm, đặt các đoạn đó trên đĩa Petri có môi trƣờng phân lập (môi trƣờng MMN), sau đó chuyển vào tủ ấm 30oC trong thời gian 48-72 giờ.
Lựa chọn và lƣu giữ giống: Từ các sợi nấm mọc ra từ các mô rễ cây ở các đĩa phân lập, ria cấy trên môi trƣờng MMN để tinh sạch chủng. Lựa chọn các chủng sạch để cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng khoai tây sau đó lại cấy truyền cho việc lƣu giữ giống và dùng cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phƣơng pháp phân loại bằng hình thái và sinh học phân tử
2.2.2.1. Phân loại các chủng nấm AM.
Tất cả bào tử sau khi phân lập sẽ đƣợc chia thành các nhóm khác nhau dựa trên tiêu chí cơ bản về màu sắc và hình thái.
Từ mỗi nhóm bào tử, chọn ra từ 5 – 10 bào tử tiêu biểu nhất cho nhóm để làm tiêu bản tạm thời bào tử bằng thuốc nhuộm PVLG và Melzer.
Quan sát bào tử ghi lại hình dạng, màu sắc, kích thƣớc, số vách bào tử, kích thƣớc vách bào tử dƣới kính hiển vi điện tử.
- Phân loại sơ bộ bào tử phân lập đƣợc đến cấp chi theo các tiêu chí tại INVAM (http://invam.caf.wvu.edu/fungi/taxonomy/speciesID.htm).
Phân loại nấm rễ AM bằng phương pháp sinh học phân tử.
- Tách chiết rADN: theo phƣơng pháp của Schwarzott và Schussler (2001).
- Trình tự mồi: trình tự 7 mồi trong đó có 2 mồi thông dụng (universal): ITS4, ITS1F và 5 mồi đặc trƣng của đoạn ribosome từ 18-28S và trên đoạn ITS đã đƣợc tổng hợp theo công bố của Redecker (2000)
- Phản ứng PCR: phản ứng PCR đƣợc thực hiện với kỹ thuật PCR ổ (nested PCR) bằng hai bƣớc. Bƣớc 1 sử dụng cặp mồi ITS1F và ITS4 để khuyếch đại đoạn DNA ở vùng ribosome của các chủng AM. Bƣớc hai là sử dụng các cặp mồi đặc hiệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Glom1310, Letc1670, Acau1660, GiGa5.8R, Arch1311 để khuếch đại các đoạn rADN đặc trƣng của loài.
- Trình tự các đoạn ribosome DNA sau đó đƣợc xác định trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 và xử lý bằng chƣơng trình DNAstar Lasergen, ClustalW. Sau đó trình tự này đƣợc so sánh với dữ liệu trên Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI). Cây phân loại đƣợc xử lý bằng chƣơng trình Mega 5.2 với phƣơng pháp Neighbor- Joining với phƣơng pháp Bootstrap với số lần lặp là 10.000 lần.
2.2.2.2. Phân loại các chủng nấm EM
Phân loại nấm bằng hình thái
- Nấm đƣợc cấy trên môi trƣờng LCA trên đĩa Peptri, trong tủ 250C từ 1-2 tuần. Quan sát trực tiếp khuẩn lạc dƣới kính quang học với độ phóng đại 200 lần.
- Nhỏ một giọt xanh cotton blue 0.1% (hoặc nƣớc vô trùng) lên lam kính có chứa khuẩn lạc nấm. Đặt lamen lên, quan sát dƣới kính hiển vi quang học với các vật kính có độ phóng đại 400 lần và 1000 lần. Đo kích thƣớc, và chụp ảnh hình thái cấu trúc các cơ quan sinh sản của nấm. Sau đó so sánh với khóa phân loại của các tác giả uy tín trên thế giới nhƣ Klich, Keith, Domsch, Seifert tìm ra sự tƣơng đồng giữa hình ảnh của chủng nấm cần phân loại và hình ảnh trong sách, từ đó đƣa ra kết luận. Phân loại nấm bằng sinh học phân tử
Tách ADN cho phản ứng PCR John Pitkin
Phản ứng PCR Hỗn hợp phản ứng: 10X Buffer 10µl dNTP mixture 16µl Mồi xuôi 2µl Mồi ngƣợc 2µl TaqTm 1.2 µl Mẫu ADN (50 ng) 1 µl Nƣớc cất đến 100µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mồi ngƣợc ITS4: 5' - TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3' Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Kiểm tra các sản phẩm PCR trên gen agarose
Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit của QIAgen (Invitrogen, Đức). Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu.
Phản ứng khuếch đại ADN cho sequencing.
Các sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc khuếch đại với bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing và đệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem)
Chu trình nhiệt khuếch đại ADN cho sequencing: Sản phẩm lúc này là các đoạn ADN đơn đƣợc duỗi ra.
Tinh sạch sản phẩm cho sequencing.
Đọc trình tự ADN. Trình tự của đoạn D1/D2 rADN 28S của chủng nấm đƣợc đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự đƣợc so sánh với các trật tự của các loài đã đƣợc xác định trong ngân hàng gen.
Xây dựng cây phân loại sử dụng phần mềm Cluxstal phiên bản 1.83 và NJ tree.
2.2.3. Tuyển chọn các chủng nấm hữu hiệu để sản xuất chế phẩm thử nghiệm
2.2.3.1. Phương pháp thử hoạt tính enzyme phosphataza của nấm vùng rễ (EM)
Hoạt tính enzyme đƣợc xác định theo nguyên lý khuếch tán trên thạch, bằng phƣơng pháp khoan lỗ thạch; dịch nuôi nấm đã loại bỏ khuẩn ty (dịch enzyme thô) đƣợc đƣa vào các lỗ đục trên đĩa thạch đã chứa các cơ chất tƣơng ứng của các enzyme. Các đĩa có lỗ thạch chứa dịch enzyme thô đƣợc để trong tủ lạnh 3-5h, rồi để trong tủ ấm 18-24h, để enzyme khuếch tán và tác dụng với cơ chất. Đƣờng kính của các vùng phân hủy ấy (mm) biểu thị hoạt độ của các enzyme của dịch nuôi nấm.
2.2.3.2. Phương pháp định lượng khả năng phân giải phốt phát khó tan
Khả năng phân giải phốt phát của vi sinh vật đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng phốt pho hữu hiệu (hòa tan) trong dịch nuôi cấy [TCVN 8565:2010]. Các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi cấy lắc trong môi trƣờng Pikovskaya
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
trong 7 -10 ngày. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 6000 vòng/phút trong 20 phút, gạn lấy phần nƣớc trong; Hàm lƣợng phốt pho trong dung dịch chiết đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang sau khi đã phân huỷ gốc xitrat. Đo màu xanh molipden do phản ứng của phốt pho với molypdat tạo thành phức đa dị vòng có màu xanh khi bị khử, từ đó suy ra hàm lƣợng phốt pho hữu hiệu (hòa tan) trong mẫu
2.2.3.3. Xác định khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng nấm vùng rễ rễ
Các chủng sẽ đƣợc đánh giá khả năng sinh chất kính thích sinh trƣởng theo phƣơng pháp Salkowsky cải tiến của Misra và Kaushik B.D. 1989.
Vi sinh vật đƣợc nuôi cấy lắc 200 vòng/phút tại 30oC trong 48 giờ (cho nấm). Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Dịch nổi đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng IAA trong mẫu. Bổ sung 2 ml dịch mẫu vào 8 ml thuốc thử cải tiến và lắc đều. Để yên trong 20 phút, sau đó so màu ở bƣớc sóng quang 530nm. Khi tác dụng với thuốc thử, hỗn hợp phản ứng cho màu hồng nhạt đến đỏ, tùy theo hàm lƣợng chất IAA có trong dịch nuôi cấy.
2.2.3.4. Xác định khả năng đối kháng giữa các chủng nấm vùng rễ
Với mục đích tạo ra dạng chế phẩm có chứa hỗn hợp các vi sinh vật sống ( nấm vùng rễ) có khả năng phân giải các hợp chất phos phát khó tan và tăng kích thích sinh trƣởng của cây trồng. Tất cả các chủng phân lập đƣợc nuôi cấy trên một môi trƣờng dinh dƣỡng, các chủng đƣợc thử theo từng cặp quan sát sự sinh trƣởng của chúng. Nếu 2 chủng không đối kháng hay ức chế sự phát triển lẫn nhau mà vẫn đảm bảo đƣợc hoạt tính thì có thể kết luận đƣợc, sự sinh trƣởng và sản phẩm trao đổi chất của chủng này, không ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng cũng nhƣ các chất trao đổi của chủng kia.
2.2.3.5. Kiểm tra tính an toàn của các chủng nấm lựa chọn
Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y đã tiến hành xác định độc lực và khả năng gây bệnh trên động vật của các chủng nấm có lợi sử dụng cho cây trồng. Theo phƣơng pháp của Cater, G.R (1984)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các chủng đƣợc mang đi hoạt hóa (Môi trƣờng ống nghiệm thạch) Các chủng nấm vùng rễ đã lựa chọn
Thu dịch lên men của từng chủng lựa chọn khác nhau
Nhân giống cấp 1
(Từng chủng riêng rẽ, lắc ổn nhiệt và trên môi trƣờng dịch thể)
Lên men trong thiết bị lên mem 15 lít
(Sục khí, nhiệt độ, pH và môi trƣờng tối ƣu)
Nhân giống cấp 2
(Từng chủng riêng rẽ, trên bình 2L có sục khí và môi trƣờng dịch thể và ổn nhiệt)
2.2.4. Tạo chế phẩm thử nghiệm trong quy mô phòng thí nghiệm.
2.2.4.1. Lên mem các chủng nấm lựa chọn tạo sinh khối vi sinh vật
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi đƣa ra sơ đồ lên men các chủng vi sinh vật qui mô phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm lên men dịch thể
(cho từng chủng riêng rẽ) Thiết bị lên men 15 lít x 03 nồi, sục khí
Phối trộn với chất mang
(Vlên men: Wchất mang=1:2) Sấy 400C, độ ẩm 10%
Đóng gói, bảo quản chế phẩm rắn
(Mật độ: 108 VSV/g)
Trộn với than bùn (1:1) Sản phẩm phối trộn của các chủng
( 1:1:1:1:1:1)
Đóng chai, bảo quản chế phẩm dạng lỏng
(Mật độ: 108 VSV/ml)
2.2.4.2. Quy trình phối trộn tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm
Quy trình sản xuất chế phẩm ở quy mô Phòng thí nghiệm đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Chế phẩm đƣợc lƣu giữ ở các nhiệt độ 300C- 350C (ở nhiệt độ phòng), sau khoảng thời gian 1 đến 6 tháng mang đi xác định mật độ vi sinh vật trên môi trƣờng đặc hiệu.
2.2.5. Thử nghiệm chế phẩm
2.2.5.1. Thử nghiệm chế phẩm trên cây lúa
Vật liệu thí nghiệm là giống lúa Khang Dân 18. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong vụ xuân và vụ mùa năm 2012 tại nhà lƣới của Khoa Nông học, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội
Qui trình thử nghiệm chế phẩm trên cây lúa với 2 loại chế phẩm sử dụng là NR-SH1 là dạng lỏng và NR-SH2 dạng rắn. Cây mạ 3-4 lá tuổi đƣợc trồng trong chậu có đƣờng kính 0,04m2, mỗi chậu chứa 5 kg đất phù sa. Tiến hành xử lý chế phẩm bằng cách trộn đều 1% chế phẩm với đất trồng, thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên RCBD với 4 lần nhắc lại.
Các phương pháp và chỉ tiêu theo dõi:
Đất ở các chậu thí nghiệm đƣợc lấy mẫu trƣớc và sau khi trồng để phân tích hàm lƣợng đạm, lân và kali dễ tiêu trong đất lần lƣợt theo các phƣơng pháp của Tiurin và Kônônôva, Oniani, và Matslova đo bằng quang kế ngọn lửa.
Tại các thời điểm đẻ nhánh hữu hiệu (sau gieo 45 ngày trong vụ xuân và 30 ngày trong vụ mùa), trỗ và chín sáp (sau trỗ 2 tuần), tiến hành đo các chỉ tiêu diện tích lá còn xanh bằng máy Licor – 3100 đồng thời đo chiều dài rễ, thân, lá đem sấy khô ở 80oC trong 48 giờ để xác định khối lƣợng chất khô toàn cây.Tại thời điểm thu hoạch, tiến hành cân năng suất cá thể của từng cây và các yếu tố cấu thành năng suất là số bông/khóm, số hạt/bông, tỉ lệ hạt chắc và khối lƣợng 1000 hạt. Số liệu đƣợc phân tích và xử lý theo phƣơng pháp phân tích phƣơng sai ANOVA bằng chƣơng trình MINITAB 16.
2.2.5.2. Thử nghiệm chế phẩm trên cây cà chua
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong nhà lƣới khoa Nông học ở trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội, vụ xuân hè 2012. Qui trình thử nghiệm chế phẩm trên cây cà chua.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hạt giống cà chua đƣợc ƣơm gieo trƣớc một tháng trên luống đất trồng, lựa chọn các cây giống khỏe, đều nhau, không sâu bệnh. Sau đó cây đƣợc chuyển sang trồng trong chậu 35cm x 30 cm, mỗi chậu chứa 10kg đất. Sử dụng hai loại chế phẩm dạng lỏng và dạng rắn NR-SH1, NR-SH2 trộn 1% chế phẩm với đất trồng. Thí nghiệm bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD), nhắc lại 3 lần.
Các phương pháp và chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian sinh trưởng và khả năng sinh trưởng
o Chiều dài thân chính (cm): Theo dõi 5 cây/công thức, 7 ngày 1 lần.
o Số lá thân chính: Theo dõi 5 cây/công thức, 7 ngày 1 lần.
o Diện tích lá, kích thƣớc lá
o
Khối lƣợng tƣơi và khô toàn cây Chỉ tiêu phát triển
o Số chùm hoa trên thân chính và nhánh.
o Số hoa/chùm.
o Tỉ lệ đậu quả:
Tỉ lệ đậ quả (%) = Tổng số quả/Tổng số hoa × 100 Các yếu tố cấu thành năng suất
o Số quả/cây.
o Khối lƣợng trung bình quả.
o Năng suất cá thể (kg/cây) = số quả trên cây * khối lƣợng trung bình quả.
o Năng suất lý thuyết/m2
. Hình thái và chất lượng quả
o Kích thƣớc quả, chất lƣợng quả (độ Brix, đƣờng tổng số, vitamin C).
Phƣơng pháp xử lý số liệu:Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm IRRISTAT 5.0.
2.2.5.3. Thử nghiệm trên cây khoai tây
Thí nghiệm tiến hành trên đất ruộng lúa nƣớc tại xã Hiệp Cƣờng – huyện Kim Động – tỉnh Hƣng Yên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Củ giống khoai tây phải chọn những củ đã có các mầm nhỏ mọc trên các mắt, lƣợng giống: 40 kg/sào Bắc bộ (360 m2), trồng hàng đơn, cây cách cây 40 cm, 1 củ /hốc, nhƣ vậy mật độ trồng là 23.800 cây/ha. Tiến hành xử lý chế phẩm bằng cách rắc chế phẩm vào các luống thí nghiệm với tỉ lệ 150g chế phẩm/m2. Dùng hai loại chế phẩm NR-SH1 và NR-SH2.
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo phƣơng pháp khối ngẫu nhiên, diện tích mỗi công thức là 210m2 (50 m x 4.2 m), thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Chăm sóc, tƣới nƣớc, vun xới, làm cỏ theo quy trình thông thƣờng.
Các chỉ tiêu theo dõi.
o Thời gian qua các giai đoạn sinh trƣởng
o Động thái chiều cao cây, ra lá trên thân chính. Theo dõi 2 tuần/lần từ sau trồng đến thời điểm 1 tháng trƣớc thu hoạch. Theo dõi 10 cây/ô thí nghiệm.
o Diện tích lá, chất khô tích luỹ ở các bộ phận trên và dƣới mặt đất. Theo dõi tại 2 thời kỳ: 40 và 70 ngày sau trồng. Lấy mẫu 5 cây/ô thí nghiệm
o Tách toàn bộ lá tƣơi, đo diện tích lá bằng máy đo diện tích lá LICOR 6000.Các bộ phận đƣợc đem sấy ở nhiệt độ 80oC đến khi khối lƣợng không